内皮RNF20抑制内皮-间质转化并保护生理性血管分泌信号以预防先天性心脏病

Endothelial RNF20 suppresses endothelial-to-mesenchymal transition and safeguards physiological angiocrine signaling to prevent congenital heart disease.

作者信息Yanliang Dou, Nalan Tetik-Elsherbiny, Rui Gao, Yonggang Ren, Yu-Wen Chen, Moritz Merbecks, Aadhyaa Setya, Olga Lityagina, Yinuo Wang, Evgeny Chichelnitskiy, Aya Abouissa, Chi-Chung Wu, Guillermo Barreto, Michael Potente, Thomas Wieland, Roxana Ola, Philippe Grieshaber, Tsvetomir Loukanov, Matthias Gorenflo, Joerg Heineke, Julio Cordero, Gergana Dobreva

PMID41145490

期刊Nat Commun

发布时间2025-10-27

DOI10.1038/s41467-025-65291-0

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实验完整度

高

包含小鼠条件敲除模型、患者样本、单细胞测序、体外细胞实验及ChIP-seq机制验证

主要模型

Isl1cre/+Rnf20fl/fl小鼠胚胎心脏 Cdh5CreERT2-Rnf20fl/fl小鼠内皮特异性敲除模型 HUVECs TOF患者心脏样本

重点核对

Isl1cre/+Rnf20fl/fl和Cdh5CreERT2-Rnf20fl/fl小鼠中Rnf20敲除效率（qPCR和H2Bub1免疫染色） TOF患者样本中RNF20表达与SpO2及TGF-β组分的相关性（n=25） HUVECs中RNF20敲低后p-SMAD2/3阳性细胞比例及迁移实验 mESC定向分化ECs中shRnf20对PECAM1+细胞比例及VE-Cadherin表达的影响共培养体系中NRG1、SMAD2/3或SMAD4敲低对心肌细胞增殖和收缩力的 rescue 效果

摘要

心脏形态发生和功能依赖于不同心脏细胞类型之间的复杂通讯。它们协同发育和相互作用如何协调，在很大程度上尚未被探索。我们的研究揭示了组蛋白H2B泛素（H2Bub1）连接酶RNF20在第二心场发育和心脏内皮细胞中的关键功能。我们证明，RNF20通过RNF20-H2Bub1依赖机制促进Nrg1表达，并通过影响内皮细胞中TGF-β靶基因的RNA聚合酶II暂停释放来抑制TGF-β信号。RNF20缺失后TGF-β信号增强导致内皮-间质转化（EndMT），而Nrg1信号受损和TGF-β活性升高共同导致心肌细胞增殖和收缩力异常。重要的是，先天性心脏病患者心脏内皮细胞中RNF20表达显著降低，与氧饱和度呈正相关，与TGF-β信号的关键组分和下游效应物呈负相关。总之，我们的工作确定了RNF20在维护内皮身份和生理性血管分泌信号中的关键作用，从而确保心脏正常发育和功能。

患者样本中RNF20表达与临床参数关联分析

探究RNF20在TOF患者中的表达变化及其与氧饱和度和TGF-β信号的相关性

对TOF患者右心室流出道标本进行bulk RNA-seq和scRNA-seq，收集临床参数（SpO2、右心室压力、年龄），进行Spearman相关性分析；并在HUVECs中暴露于1%氧气24小时检测RNF20 mRNA。

SHF特异性Rnf20敲除小鼠心脏发育表型分析

验证Rnf20在第二心场发育中的作用

使用Isl1-Cre驱动Rnf20条件敲除，分析胚胎心脏形态、收缩力、组织学、心肌细胞和内皮细胞增殖及凋亡；并进行scRNA-seq。

内皮特异性Rnf20敲除小鼠心脏功能验证

验证内皮RNF20在心脏发育和功能中的作用

使用Cdh5-CreERT2在E8.5诱导内皮特异性Rnf20敲除，分析胚胎心脏收缩力、组织学、心肌细胞增殖；并在P1诱导出生后敲除，分析P7心脏表型；同时进行scRNA-seq。

EndMT体外验证

验证RNF20缺失是否促进内皮-间质转化

对E10.5心脏近端OFT进行胶原凝胶外植体培养，观察间充质细胞突出和伪足长度；在HUVECs中进行划痕实验和成管实验；在mESC定向分化ECs中敲低Rnf20，检测VE-Cadherin和Snai1表达。

TGF-β信号激活及功能 rescue 验证

验证RNF20缺失通过TGF-β信号介导EndMT和心肌细胞功能障碍

在HUVECs中敲低RNF20后检测p-SMAD2/3；在共培养体系中敲低SMAD2/3或SMAD4，或补充NRG1、IGF2，检测心肌细胞增殖和收缩力。

RNF20调控Pol II暂停释放的机制解析

解析RNF20如何调控TGF-β靶基因和生长因子基因的转录

在HUVECs中敲低RNF20后进行H2Bub1 ChIP-seq、Pol II ChIP-seq和TFIIS ChIP-seq，计算暂停指数，并用ChIP-qPCR验证TGFB1、TGFBR2、THBS1、CCL2等基因。

实验环节	名称	品牌	货号
内皮细胞诱导敲除	(Z)-4-羟基他莫昔芬	Sigma	H7904
中链甘油三酯	Caelo	3274
细胞培养	内皮细胞生长培养基MV 2	PromoCell	C-22022
DMEM培养基	Thermo Fisher Scientific	10270106
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270106
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030123
心脏内皮细胞分离	DNase I	Worthington	2139
I型胶原酶	Worthington	4197
HBSS缓冲液	Thermo Fisher Scientific	14175053
内皮细胞磁珠分选	CD31抗体	BD Biosciences	553370
Dynabeads磁珠	Invitrogen	11035
mESC培养	KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018
KnockOut血清替代物	Thermo Fisher Scientific	10828028
非必需氨基酸	Thermo Fisher Scientific	11140035
白血病抑制因子	Millipore	ESG1107
丝裂霉素	Sigma-Aldrich	M4287
mESC分化	明胶	Sigma-Aldrich	G9391
Neurobasal培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049
DMEM F-12培养基	Thermo Fisher Scientific	21331020
N2添加剂	Thermo Fisher Scientific	17502048
B27添加剂	Thermo Fisher Scientific	17504044
牛白蛋白V组分	Thermo Fisher Scientific	15260037
单硫代甘油	Sigma-Aldrich	M6145
骨形态发生蛋白4	R&D Systems	314-BP
IMDM培养基	Thermo Fisher Scientific	12440061
Ham's F-12营养混合物	Thermo Fisher Scientific	21765029
无维生素A的B27添加剂	Thermo Fisher Scientific	12587010
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403
血管内皮生长因子A	R&D Systems	293-VE-010
激活素A	R&D Systems	338-AC
基质胶	Corning	354230
富含脂质的牛血清白蛋白	Thermo Fisher Scientific	11020013
流式细胞术	APC偶联抗CD31抗体	eBioscience	17-0311-80
Sytox Blue死细胞染料	Invitrogen	S34857
RNA干扰	Lipofectamine RNAiMAX转染试剂	Thermo Fisher Scientific	13778075
慢病毒转导	X-tremeGENE HP DNA转染试剂	Roche	6366236001
共培养	Transwell小室	Sarstedt	83.3932.041
I型胶原蛋白	Thermo Fisher Scientific	A1048301
EndMT胶原凝胶实验	鼠尾I型胶原蛋白	Ibidi	50201
M199培养基	Thermo Fisher Scientific	11825015
成管实验	µ-Slide血管生成载玻片	Ibidi	81506
免疫染色	磷酸化SMAD2/3抗体	Cell Signaling	D27F4
免疫荧光	抗肌球蛋白重链抗体	DSHB	--
抗磷酸化组蛋白H3抗体	Cell Signaling	9701S
抗泛素化组蛋白H2B抗体	Cell Signaling	5546
Isolectin B4-Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	I32450
WGA-Alexa Fluor 633	Invitrogen	W21404
Isolectin B4-Alexa Fluor 488	Invitrogen	I21411
抗CD31抗体	BD	553370
抗肌钙蛋白I抗体	abcam	ab56357
EdU检测	Click-iT EdU Alexa Fluor 488试剂盒	Thermo Fisher Scientific	C10337
凋亡检测	FragEL DNA断裂检测试剂盒	Sigma-Aldrich	QIA33
封片	Mowiol 4-88封片剂	Millipore	475904
ROTI Histokitt封片剂	Carl Roth	6638.1
RNA提取	TRIzol RNA提取试剂	Invitrogen	15596018
逆转录	High Capacity cDNA逆转录试剂盒	Applied Biosystems	4368813
实时定量PCR	SYBR GREEN PCR预混液	Applied Biosystems	A25742
qPCR BIO SyGreen Blue Hi-ROX预混液	Nippon Genetics	--
RNA测序	RNeasy Plus Universal Mini试剂盒	Qiagen	73404
单细胞RNA测序	Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1	10xGenomics	1000269
Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒	10xGenomics	1000127
SYTOX Blue死细胞染料	Thermo Fisher Scientific	S34857
ChIP	Pol II抗体	Cell Signaling	14958S
TFIIS抗体	Abcam	ab185947

实验环节

名称

品牌

货号

内皮细胞诱导敲除

(Z)-4-羟基他莫昔芬

Sigma

H7904

中链甘油三酯

Caelo

3274

细胞培养

内皮细胞生长培养基MV 2

PromoCell

C-22022

DMEM培养基

Thermo Fisher Scientific

10270106

胎牛血清

Thermo Fisher Scientific

10270106

青霉素-链霉素

Thermo Fisher Scientific

15140122

L-谷氨酰胺

Thermo Fisher Scientific

25030123

心脏内皮细胞分离

DNase I

Worthington

2139

I型胶原酶

Worthington

4197

HBSS缓冲液

Thermo Fisher Scientific

14175053

内皮细胞磁珠分选

CD31抗体

BD Biosciences

553370

Dynabeads磁珠

Invitrogen

11035

mESC培养

KnockOut DMEM

Thermo Fisher Scientific

10829018

KnockOut血清替代物

Thermo Fisher Scientific

10828028

非必需氨基酸

Thermo Fisher Scientific

11140035

白血病抑制因子

Millipore

ESG1107

丝裂霉素

Sigma-Aldrich

M4287

mESC分化

明胶

Sigma-Aldrich

G9391

Neurobasal培养基

Thermo Fisher Scientific

21103049

DMEM F-12培养基

Thermo Fisher Scientific

21331020

N2添加剂

Thermo Fisher Scientific

17502048

B27添加剂

Thermo Fisher Scientific

17504044

牛白蛋白V组分

Thermo Fisher Scientific

15260037

单硫代甘油

Sigma-Aldrich

M6145

骨形态发生蛋白4

R&D Systems

314-BP

IMDM培养基

Thermo Fisher Scientific

12440061

Ham's F-12营养混合物

Thermo Fisher Scientific

21765029

无维生素A的B27添加剂

Thermo Fisher Scientific

12587010

L-抗坏血酸

Sigma-Aldrich

A4403

血管内皮生长因子A

R&D Systems

293-VE-010

激活素A

R&D Systems

338-AC

基质胶

Corning

354230

富含脂质的牛血清白蛋白

Thermo Fisher Scientific

11020013

流式细胞术

APC偶联抗CD31抗体

eBioscience

17-0311-80

Sytox Blue死细胞染料

Invitrogen

S34857

RNA干扰

Lipofectamine RNAiMAX转染试剂

Thermo Fisher Scientific

13778075

慢病毒转导

X-tremeGENE HP DNA转染试剂

Roche

6366236001

共培养

Transwell小室

Sarstedt

83.3932.041

I型胶原蛋白

Thermo Fisher Scientific

A1048301

EndMT胶原凝胶实验

鼠尾I型胶原蛋白

Ibidi

50201

M199培养基

Thermo Fisher Scientific

11825015

成管实验

µ-Slide血管生成载玻片

Ibidi

81506

免疫染色

磷酸化SMAD2/3抗体

Cell Signaling

D27F4

免疫荧光

抗肌球蛋白重链抗体

DSHB

抗磷酸化组蛋白H3抗体

Cell Signaling

9701S

抗泛素化组蛋白H2B抗体

Cell Signaling

5546

Isolectin B4-Alexa Fluor 647

Thermo Fisher Scientific

I32450

WGA-Alexa Fluor 633

Invitrogen

W21404

Isolectin B4-Alexa Fluor 488

Invitrogen

I21411

抗CD31抗体

553370

抗肌钙蛋白I抗体

abcam

ab56357

EdU检测

Click-iT EdU Alexa Fluor 488试剂盒

Thermo Fisher Scientific

C10337

凋亡检测

FragEL DNA断裂检测试剂盒

Sigma-Aldrich

QIA33

封片

Mowiol 4-88封片剂

Millipore

475904

ROTI Histokitt封片剂

Carl Roth

6638.1

RNA提取

TRIzol RNA提取试剂

Invitrogen

15596018

逆转录

High Capacity cDNA逆转录试剂盒

Applied Biosystems

4368813

实时定量PCR

SYBR GREEN PCR预混液

Applied Biosystems

A25742

qPCR BIO SyGreen Blue Hi-ROX预混液

Nippon Genetics

RNA测序

RNeasy Plus Universal Mini试剂盒

Qiagen

73404

单细胞RNA测序

Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1

10xGenomics

1000269

Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒

10xGenomics

1000127

SYTOX Blue死细胞染料

Thermo Fisher Scientific

S34857

ChIP

Pol II抗体

Cell Signaling

14958S

TFIIS抗体

Abcam

ab185947

环节	核对要点
小鼠模型与基因敲除	Isl1-Cre和Cdh5-CreERT2驱动系背景、Rnf20fl/fl等位基因来源、他莫昔芬诱导剂量（2 mg/30 g体重，连续3天）和诱导时间点（E8.5）阅读提示：Methods中Mouse lines和Cre-mediated gene ablation小节
缺氧处理	HUVECs缺氧条件（1% O2，24 h）、对照常氧条件、n=3 阅读提示：Fig. 1e图注及Results对应段落
EndMT胶原凝胶实验	OFT外植体来源（E10.5）、胶原浓度（1 mg/ml）、培养时间（72 h）、血清浓度（1% FBS）、n=6 阅读提示：Methods中EndMT collagen gel assay小节及Fig. 6a,b图注
共培养体系	EC与rCM接种比例/密度、共培养时间（48 h）、4-OHT浓度（10 nM，72 h）、transwell孔径、n值阅读提示：Methods中Co-culture of ECs with CMs小节及Figs. 7–9图注
ChIP-seq和ChIP-qPCR	抗体用量（1 µg/IP）、ChIP实验重复数（n=3–4）、Pol II暂停指数计算参数（TSS -50至300 bp，基因体300 bp至3 kb）阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-sequencing data analysis小节及Fig. 10图注

环节

核对要点

小鼠模型与基因敲除

Isl1-Cre和Cdh5-CreERT2驱动系背景、Rnf20fl/fl等位基因来源、他莫昔芬诱导剂量（2 mg/30 g体重，连续3天）和诱导时间点（E8.5）

阅读提示：Methods中Mouse lines和Cre-mediated gene ablation小节

缺氧处理

HUVECs缺氧条件（1% O2，24 h）、对照常氧条件、n=3

阅读提示：Fig. 1e图注及Results对应段落

EndMT胶原凝胶实验

OFT外植体来源（E10.5）、胶原浓度（1 mg/ml）、培养时间（72 h）、血清浓度（1% FBS）、n=6

阅读提示：Methods中EndMT collagen gel assay小节及Fig. 6a,b图注

共培养体系

EC与rCM接种比例/密度、共培养时间（48 h）、4-OHT浓度（10 nM，72 h）、transwell孔径、n值

阅读提示：Methods中Co-culture of ECs with CMs小节及Figs. 7–9图注

ChIP-seq和ChIP-qPCR

抗体用量（1 µg/IP）、ChIP实验重复数（n=3–4）、Pol II暂停指数计算参数（TSS -50至300 bp，基因体300 bp至3 kb）

阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-sequencing data analysis小节及Fig. 10图注

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