缺血模型中CCL28/CCR10轴表达验证
确认CCL28及其受体CCR10在心肌和后肢缺血中被上调及细胞来源。
在WT小鼠HI和MI模型的特定时间点，用RT-qPCR、Western blot、ELISA、免疫荧光和流式细胞术检测Ccl27/Ccl28、Ccr3/Ccr10表达及CCL28+、CCR10+细胞亚群；并用单细胞核RNA-seq数据库分析人缺血性心肌病样本。
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CCL28通过CCR10+内皮细胞促进雄性小鼠心肌梗死后血管新生与心脏修复
CCL28 contributes to angiogenesis and cardiac repair through CCR10+ endothelial cells after myocardial infarction in male mice.
实验完整度
高含体外内皮细胞功能、RNA-seq/ChIP/双荧光素酶机制验证、MI与HI小鼠模型及416例CTO患者队列
主要模型
雄性C57BL/6J小鼠心肌梗死模型 雄性C57BL/6J小鼠后肢缺血模型 db/db糖尿病小鼠缺血模型 416例慢性完全闭塞患者队列
重点核对
rCCL28腹腔注射剂量50 μg/kg，每4天一次，首次于手术当日给药 AAV9-Tie1-sh-CCR10尾静脉注射2×10^11 vg/小鼠，4周后造模 体外rCCL28处理浓度10 ng/mL作用24 h HI后7天、MI后3天为CCL28/CCR10表达检测主要时间点 Ccl28-KO与同窝WT对照，HI血流n=8/组、MI超声n=6/组
摘要
基于分泌组的靶向血管新生疗法是治疗缺血性心脏病（IHD）的有前景策略。趋化因子C-C基序配体（CCL）28对IHD的作用尚不清楚。本研究利用心肌梗死（MI）和后肢缺血（HI）模型，在雄性小鼠中研究CCL28在IHD血管新生中的作用。在HI和MI中观察到CCL28/C-C基序受体（CCR）10轴上调。此外，CCR10在内皮细胞（EC）中高表达。与CCR10- EC相比，CCR10+ EC表现出更强的促血管新生能力，该能力由CCL28通过CCR10/ERK/SOX5正反馈信号诱导。CCL28缺失导致血管新生受损，而使用重组CCL28蛋白对心肌和后肢缺血（包括糖尿病情况）具有治疗潜力。内皮特异性CCR10缺失损害血管新生，并阻断rCCL28在缺血模型中的治疗效果。血清CCL28水平对慢性完全闭塞患者的冠状动脉侧支血管（CCV）具有预测作用。本研究强调CCL28的促血管新生作用，并提示重组CCL28蛋白可能成为减轻IHD的潜在治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCL28是否在缺血性心脏病中调控血管新生及其机制与治疗潜力如何。
- 核心机制
- CCL28通过CCR10/ERK/SOX5正反馈信号促进CCR10+内皮细胞的促血管新生功能。
- 主要证据
- MI与HI小鼠模型、Ccl28-KO、rCCL28给药、AAV9-Tie1-sh-CCR10、内皮细胞功能实验、RNA-seq、ChIP-qPCR与双荧光素酶报告实验，以及416例CTO患者血清CCL28与Rentrop评分分析。
- 研究意义
- 提示重组CCL28蛋白可能成为减轻心肌和后肢缺血（包括糖尿病情况）的潜在治疗选择，并揭示CCL28在CTO患者中的临床预测意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CCR10+内皮细胞功能鉴定
比较CCR10+与CCR10-内皮细胞的促血管新生能力。
流式分选CCR10+与CCR10- EC，检测Ki67、缺氧24 h后Annexin V/PI凋亡、划痕迁移、球体出芽、管形成、H2O2诱导衰老及血管新生基因表达。
CCL28/CCR10/ERK/SOX5机制验证
验证CCL28经CCR10/ERK/SOX5正反馈调控Ccr10转录。
rCCL28浓度梯度处理EC，结合Ccl28-KO小鼠内皮RNA-seq、GSEA、siRNA敲低、ERK抑制剂Ravoxertinib与CCR10抑制剂BI-6901、ChIP-qPCR及双荧光素酶报告实验。
CCL28缺失与rCCL28治疗的体内验证
评估CCL28对缺血后血流恢复、血管密度、纤维化和心功能的作用。
Ccl28-KO与WT小鼠行股动脉结扎或冠状动脉结扎；WT及KO小鼠腹腔注射rCCL28或vehicle，检测激光多普勒血流、CD31/IB4免疫荧光、Masson染色、超声心动图和FITC-dextran通透性。
内皮特异性CCR10缺失验证依赖性
验证CCL28促血管新生作用依赖CCR10+内皮细胞。
尾静脉注射AAV9-Tie1-sh-CCR10或对照4周后行HI或MI，并给予rCCL28或vehicle，检测CCR10表达、血流恢复、血管密度、纤维化和心功能。
糖尿病缺血模型治疗验证
评估CCL28-CCR10轴在糖尿病缺血中的作用及rCCL28疗效。
db/db小鼠行HI或MI，检测CCL28/CCR10表达及CCR10+CD31+ EC比例，并给予rCCL28检测血管密度、血流恢复、纤维化、梗死面积和创面愈合。
CTO患者血清CCL28与CCV关联分析
评估血清CCL28对冠状动脉侧支血管的预测价值。
纳入416例稳定型心绞痛合并CTO患者，ELISA检测血清CCL28，按Rentrop评分分组，进行logistic回归、ROC、NRI和IDI分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| rCCL28处理 | 人重组CCL28蛋白 | PeproTech | 300-57 |
| 小鼠重组CCL28蛋白 | PeproTech | 250-30 | |
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 |
| CD31磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| BMDM诱导 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 315-02 |
| BMDM极化 | 白细胞介素-4 | PeproTech | AF-214-14 |
| 细胞培养 | MCDB131培养基 | Gibco | 10372019 |
| 人表皮生长因子 | sigma | E9644 | |
| 流式分析 | Zombie Aqua可固定活力检测试剂盒 | Biolegend | 423102 |
| TruStain FcX抗体 | Biolegend | 101320 | |
| AF488标记抗CCL28抗体 | Santa Cruz | sc-376654 | |
| APC/Fire 750标记抗CD45抗体 | Biolegend | 103154 | |
| PE/Cy7标记抗CD31抗体 | Biolegend | 102524 | |
| APC标记抗CD140a抗体 | Biolegend | 135908 | |
| PE标记抗Ly6C抗体 | Biolegend | 128008 | |
| PerCP/Cyanine5.5标记抗Ly6G抗体 | Biolegend | 127616 | |
| PE/Cy7标记抗CD11b抗体 | Biolegend | 101216 | |
| APC标记抗F4/80抗体 | Biolegend | 123116 | |
| AF405标记抗CCR10抗体 | R&D | FAB2815V | |
| AF488标记抗Ki67抗体 | Novus | NB110-89717AF488 | |
| APC/Cy7标记抗CD31抗体 | Biolegend | 102440 | |
| PE/Atto594标记抗CCR10抗体 | Novus | FAB2815PEATT594 | |
| 体内通透性检测 | FITC-葡聚糖（70 kDa） | Sigma | 46945 |
| 细胞培养/消化 | II型胶原酶 | -- | -- |
| IV型胶原酶 | -- | -- | |
| 中性蛋白酶 | -- | -- | |
| DNA酶I | -- | -- | |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 钙黄绿素 | Solarbio | C7600 | |
| 出芽实验 | I型胶原 | Corning | 354236 |
| 培养基199 | Sigma | M9163 | |
| 鬼笔环肽 | Solarbio | CA1610 | |
| 衰老染色 | SA-β-Gal染色试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0602 |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | 9003 |
| SOX5抗体 | Abcam | ab94396 | |
| 双荧光素酶报告 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | E1910 | |
| ELISA | 小鼠CCL28 ELISA试剂盒 | Abcam | ab210578 |
| 人CCL28 ELISA试剂盒 | Abcam | ab99988 | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-018 |
| RT-qPCR | PrimeScript含gDNA Eraser逆转录试剂盒 | Takara | RR047A |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | |
| Western blot | 抗ACTB抗体 | Abcam | ab8226 |
| 抗CCL28/MEC抗体 | Abcam | ab231557 | |
| 抗CCR10抗体 | Proteintech | 22071-1-AP | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | CST | 4370 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | CST | 4695 | |
| 抗VEGFA抗体 | Abclonal | A0280 | |
| 抗CDKN2A/p16INK4a抗体 | Abcam | ab211542 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG (H+L) | Beyotime | A0216 | |
| 免疫荧光 | 抗CD31抗体 | Abcam | ab9498 |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 594） | Abcam | ab150080 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 594） | Abcam | ab150116 | |
| GS-IB4 Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | I21413 | |
| 多重免疫组化 | Bas多靶点免疫组化试剂盒 | AXB | BXT35010011 |
| 抗CD45抗体 | Abcam | ab318154 | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab300421 | |
| 动物实验 | Vevo 2100高频超声系统 | VisualSonics | -- |
| PeriScan PIM 3激光多普勒灌注成像系统 | Perimed | -- | |
| 流式分析 | BD FACSAria III流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| BD FACSAria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 共聚焦成像 | Olympus FV3000RS共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与分组 | 小鼠品系、性别、周龄（雄性C57BL/6J、db/db，6–8周）、Ccl28-KO与同窝WT对照、sham手术对照、每组样本量 阅读提示：Methods“Animals”与“Mouse model of hindlimb or myocardial ischemia”及Fig. 1–7图注 |
| rCCL28给药方案 | 剂量50 μg/kg、每4天一次、首次给药于手术当日、腹腔注射、vehicle对照 阅读提示：Methods“Application of mouse recombinant CCL28 protein (rCCL28)”与Fig. 6、Fig. 7图注 |
| AAV9-Tie1-sh-CCR10干预 | 剂量2×10^11 vg/小鼠、尾静脉注射、注射4周后造模、sh-Control对照 阅读提示：Methods“Tail vein injection of AAV-tie1-sh-CCR10”与Fig. S8、S9 |
| 体外内皮细胞处理 | rCCL28 10 ng/mL处理24 h、缺氧24 h、H2O2 50 µM 2 h后培养48 h、ERK抑制剂Ravoxertinib与CCR10抑制剂BI-6901浓度（文中未明确说明） 阅读提示：Methods“Cell intervention”与Fig. 3、Fig. 4、Fig. S3 |
| 检测时间点与样本量 | HI后7天、MI后3天/7天；血流n=8/组、超声n=6/组、免疫荧光n=5/组、Western blot n=3/组、流式n=4/组 阅读提示：Fig. 1–7图注及Methods“Statistical analysis” |
| 临床队列与统计模型 | 416例CTO患者纳入与排除标准、Rentrop评分分组、血清CCL28 cutoff 605 pg/mL、Model 1与Model 2协变量 阅读提示：Methods“Participants and ethics”“Coronary angiography”与Fig. 8、Table 1、Table 2 |