筛选发现IRE1α抑制剂hit
从化合物库中鉴定抑制IRE1α RNase活性的小分子。
使用FRET assay筛选约10,000个化合物（5 μM），发现吲哚类IA01；用凝胶切割实验验证；DSF和ITC确认结合。
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利用吲哚骨架鉴定调节XBP1 mRNA剪接的小分子IRE1α抑制剂
Harnessing indole scaffolds to identify small-molecule IRE1α inhibitors modulating XBP1 mRNA splicing.
实验完整度
高包含体外酶学、生物物理结合、共晶结构、细胞功能及前药活性等多层级验证。
主要模型
截短型人IRE1α蛋白（547-977，去磷酸化和磷酸化形式） A549细胞 HCT 116细胞 HT-29细胞
重点核对
FRET assay中IA107对去磷酸化IRE1α和磷酸化IRE1α的IC50分别为16 nM和9 nM MST测得IA107与IRE1α和p-IRE1α的KD分别为1.36 μM和152 nM 共晶结构（PDB 9gow）分辨率3 Å，显示IA107结合于激酶结构域ATP口袋 A549细胞中IA107预处理2 h，与1 μg/mL tunicamycin共处理2 h，RT-qPCR检测XBP1剪接 前药IAPD1在A549细胞中抑制XBP1剪接的IC50为180 nM
摘要
肌醇需求酶1α（IRE1α）是一种重要的传感器蛋白，具有激酶和核糖核酸酶双重功能。它诱导X盒结合蛋白1（XBP1）mRNA剪接，并介导内质网（ER）应激触发的下游未折叠蛋白反应信号通路。IRE1α的失调与多种人类疾病相关，因此靶向IRE1α的小分子具有巨大的治疗潜力。我们在此报道了一系列取代吲哚作为IRE1α抑制剂（如IA107），具有优异的效力和选择性。我们还报道了一个解析的共晶结构，揭示了IA107独特的抑制模式：它通过结合IRE1α激酶结构域变构抑制IRE1α RNase活性，但不抑制IRE1α二聚化。以下细胞评估结果表明，IA107浓度依赖性地抑制细胞ER应激诱导的XBP1 mRNA剪接，而含酯的前药在细胞活性上表现出约50倍的增加。总之，我们的结果确立了吲哚作为一种有效的、选择性的IRE1α抑制化学型，可调节RNA剪接，并扩展了通过小分子靶向IRE1α相关的生物学应用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否发现基于吲哚骨架的新型IRE1α小分子抑制剂，并阐明其抑制机制及细胞活性？
- 核心机制
- IA107结合IRE1α激酶结构域的ATP口袋，变构导致RNase结构域二聚体界面分离，但不抑制IRE1α二聚化，从而抑制RNase活性。
- 主要证据
- FRET和凝胶切割实验证实抑制RNase活性；DSF、ITC、MST证实直接结合；共晶结构揭示结合模式；细胞实验显示IA107和前药IAPD1抑制XBP1 mRNA剪接。
- 研究意义
- 确立了吲哚作为有效、选择性的IRE1α抑制化学型，可调节RNA剪接，扩展了通过小分子靶向IRE1α的生物学应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结构修饰优化活性
通过构效关系研究提高IRE1α抑制活性。
对吲哚骨架R1、R2、R3位点进行结构修饰，合成一系列类似物，用FRET assay测试抑制活性。
生物化学和生物物理表征IA107
验证IA107的抑制活性、结合亲和力和抑制机制。
FRET assay测定IC50；凝胶切割实验；DSF热稳定性；ITC和MST测定KD；Michaelis-Menten动力学；竞争ITC；LanthaScreen激酶结合实验。
共晶结构解析结合模式
揭示IA107与IRE1α的结合模式及抑制机制。
IA107与磷酸化IRE1α共结晶，X射线衍射收集数据，解析结构至3 Å；分析相互作用和构象变化；DSS交联结合mass photometry评估二聚化。
细胞水平验证IA107及前药IAPD1
评估化合物在细胞中抑制ER应激诱导的XBP1 mRNA剪接及靶点结合。
A549、HCT 116、HT-29细胞中，化合物预处理后tunicamycin诱导ER应激，RT-qPCR检测XBP1剪接；Western blot检测XBP1s蛋白；CETSA验证靶点结合；细胞活力实验评估毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | Benzonase核酸酶 | Sigma | E1014 |
| SIGMAFAST™蛋白酶抑制剂混合物片剂 | Sigma | S8830 | |
| 镍琼脂糖凝胶6 Fast Flow | GE Healthcare | -- | |
| HiTrap Q HP阴离子交换柱 | Cytiva | -- | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| Lambda蛋白磷酸酶 | New England BioLabs | P0753S | |
| AdvanceBio脱盐反相柱 | Agilent | -- | |
| FRET assay | 双标记RNA底物 | Integrated DNA Technologies (IDT) | -- |
| 384孔黑色板 | Corning | 4514 | |
| DSF assay | SYPRO Orange荧光染料 | Sigma | S5692 |
| MST | Protein Labeling Kit RED-NHS 第二代 | NanoTemper | MO-L011 |
| DSS cross-linking | DSS（二琥珀酰亚胺辛二酸酯） | Thermo Fisher | A39267 |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | 61965026 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10500064 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞活力实验 | CCK-8溶液 | Vazyme | A311 |
| RT-qPCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 | |
| PowerUp™ SYBR™ Green预混液 | Thermo Fisher | A25742 | |
| 衣霉素 | MP Biomedi | 0215002805 | |
| CETSA | RIPA裂解液 | Sigma | R0278 |
| 磷酸酶抑制剂 | Roch | 4906845001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | |
| 4×蛋白上样缓冲液 | Invitrogen | 2463559 | |
| 4–20% MP无染色凝胶 | Bio-Rad | 4568095 | |
| 0.45 μm PVDF膜 | Bio-Rad | 1704274 | |
| 脱脂奶粉 | Roth | T145.2 | |
| IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | #3294 s | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 山羊抗兔抗体 | Proteintech | SA00001-2 | |
| Amersham ECL prime蛋白质印迹检测试剂盒 | Cytiva | RPN2232 | |
| Western blot | BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| 4–15% MP无染色凝胶 | Bio-Rad | 4568085 | |
| XBP1s抗体 | Cell Signaling Technology | #12782 s |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FRET-based IRE1α RNase activity assay | IRE1α蛋白浓度（去磷酸化40 nM，磷酸化4 nM）、RNA底物浓度（100 nM或200 nM）、化合物预孵育30 min、反应温度室温、检测时间1小时 阅读提示：Methods中FRET-based IRE1α RNase activity assay小节 |
| Gel-based RNA-cleavage assay | p-IRE1α浓度10 nM、RNA底物50 nM、化合物预孵育30 min、反应45 min、尿素-PAGE浓度15% 阅读提示：Methods中Gel-based RNA-cleavage assay小节 |
| ITC assay | 化合物浓度200 μM、IRE1α浓度10 μM、温度25°C、缓冲液组成（25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 1 mM TCEP, 5% glycerol, 1% DMSO） 阅读提示：Methods中Isothermal titration calorimetry (ITC) assay小节 |
| MST assay | IRE1α浓度20 nM、化合物最高浓度250 μM、DMSO终浓度2.5%、红色检测器激发功率60% 阅读提示：Methods中Microscale thermophoresis (MST)小节 |
| 共结晶 | p-IRE1α浓度15 mg/mL、IA107浓度1 mM、DMSO终浓度1%、储液组成（0.05 M bicine pH 9.0, 36% v/v PEG300, 0.12 M NaCl）、晶体生长温度20°C、时间3-4天 阅读提示：Methods中Co-crystallization of IA107-pIRE1α小节 |
| RT-qPCR检测XBP1剪接 | 细胞接种密度5×10^5 cells/well（6孔板）、化合物预处理2 h、tunicamycin浓度0.5 μg/mL、诱导时间2 h、RNA用量500 ng、qPCR反应体积10 μL 阅读提示：Methods中RT-qPCR小节 |
| Western blot检测XBP1s蛋白 | 细胞接种密度8×10^5 cells/well（6孔板）、化合物预处理2 h、tunicamycin浓度1 μg/mL、诱导时间4 h、上样总蛋白40 μg、抗体稀释比例（IRE1α 1:1000, XBP1s 1:1000, GAPDH 1:6000） 阅读提示：Methods中Western blot analysis of IRE1α and XBP1s protein levels小节 |