GRPIp筛选与RBP图谱构建
鉴定炎症不同阶段原代巨噬细胞的RBP图谱并筛选潜在抗炎因子
IL-1β刺激BMDM 0、1、12 h，UV交联后经相分离纯化RNA-RBP复合物，DNase与Trypsin/Lys-C处理，超滤后4D-LFQ质谱鉴定；琼脂糖凝胶与HPLC质控
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
RNA结合蛋白RRP1抑制巨噬细胞一碳代谢以抑制自身炎症
The RNA-binding protein RRP1 brakes macrophage one-carbon metabolism to suppress autoinflammation.
实验完整度
高含GRPIp/RIP-seq/seCLIP、代谢组与同位素示踪、细胞功能验证及CAIA小鼠模型
主要模型
IL-1β刺激的小鼠原代BMDM RAW 264.7巨噬细胞系（WT与RRP1 KO） THP-1衍生人巨噬细胞 髓系特异性RRP1缺陷CAIA小鼠模型
重点核对
BMDM在IL-1β刺激0、1、12 h三个时间点的分组设计 siRNA或CRISPR-Cas9介导RRP1缺失后IL-1β刺激不同时间检测Il6、Il-1b RAW 264.7中过表达全长RRP1、Nop52或Cter结构域后的炎症因子表达 L-serine-[13C3]示踪4 h与靶向代谢组检测SAM、Met、THF CAIA模型中Raltitrexed 10 mg/kg腹腔注射于第5、7天
摘要
RNA结合蛋白（RBP）对炎症的启动和消退具有重要作用，因此更好地理解RBP-RNA相互作用及其与代谢的交互作用可能为控制炎症提供替代靶点。本研究建立了全局RNA-蛋白质相互作用组纯化技术（GRPIp），用于分析炎症原代巨噬细胞中的RBP图谱，并鉴定出核糖体RNA加工蛋白1（RRP1）为炎症性天然免疫应答的抑制因子。机制上，RRP1结合核内胸苷酸合成酶（Tyms）转录本，在炎症巨噬细胞中转录后降低TYMS表达，进而抑制叶酸代谢循环并抑制一碳代谢驱动的炎症。髓系特异性RRP1缺陷小鼠发生严重的实验性关节炎，促炎细胞因子升高并出现免疫性损伤。同时，在类风湿关节炎患者中，外周血单核细胞的RRP1表达与TYMS表达及血清IL-1β水平呈负相关。因此，本研究结果提示RRP1通过转录后抑制一碳代谢而发挥抗炎因子作用，从而为控制自身炎症提供了潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 炎症巨噬细胞中哪些RBP调控炎症应答，其与一碳代谢的交互作用如何影响自身炎症？
- 核心机制
- RRP1结合核内Tyms mRNA（尤其内含子区），转录后抑制TYMS表达，抑制叶酸循环与一碳代谢通量，从而抑制炎症因子表达与自身炎症。
- 主要证据
- GRPIp筛选结合RIP-seq/seCLIP与SPR验证RRP1-Tyms结合；RRP1缺失或过表达及TYMS沉默/抑制剂实验证明TYMS介导的炎症与代谢变化；CAIA小鼠与RA患者PBMC相关性分析支持体内与临床关联。
- 研究意义
- 提示RRP1作为抗炎因子通过转录后抑制一碳代谢，为控制自身炎症及类风湿关节炎提供潜在靶点与策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选RBP的炎症功能筛选
验证候选RBP对IL-1β诱导炎症因子表达的调控作用
siRNA沉默候选蛋白后IL-1β刺激，RT-qPCR检测Il6、Il-1b、Ccl2，ELISA检测上清IL-6
RRP1缺失与结构域功能验证
确证RRP1及其Nop52结构域对多种刺激诱导炎症的抑制作用
CRISPR-Cas9构建RRP1 KO RAW 264.7，THP-1 siRNA沉默，poly(I:C)、LPS、TNFα、IL-6刺激；过表达全长、Nop52、Cter结构域；检测炎症因子、MAPK/STAT3磷酸化及细胞死亡
RRP1靶RNA鉴定与结合区域定位
明确RRP1在炎症中结合并调控的靶RNA
RIP-seq比较0 h与12 h RRP1结合RNA，RIP-qPCR验证Tyms，RNA FISH-IF观察共定位，截短体RIP定位Nop52结构域
一碳代谢表型与通量分析
验证RRP1对一碳代谢循环及通量的调控
非靶向与靶向代谢组检测WT与RRP1 KO细胞代谢物，L-serine-[13C3]示踪分析SAM、Met标记，外源SAM/Met/Ser回补实验
TYMS介导的机制链路验证
确认TYMS是RRP1调控一碳代谢与炎症的关键节点
siRNA沉默TYMS、TYMS过表达、TYMS抑制剂（Trifluridine、Pemetrexed、Raltitrexed）处理，检测炎症因子与SAM/Met/THF水平
转录后调控机制解析
确定RRP1抑制TYMS表达的转录后环节
核糖体沉降分析翻译、核质分离、新生RNA捕获、seCLIP与SPR分析内含子结合、免疫荧光观察核仁定位变化
体内自身炎症模型与药理干预
验证RRP1在体内自身炎症中的作用及TYMS抑制的治疗效果
髓系特异性RRP1缺陷小鼠建立CAIA模型，评估临床评分、关节病理与血清细胞因子；Raltitrexed腹腔注射干预
类风湿关节炎患者样本相关性分析
评估RRP1/TYMS与IL-1β在RA患者中的临床相关性
采集RA患者血清与PBMC，检测RRP1、TYMS mRNA与血清IL-1β，免疫荧光观察PBMC中RRP1定位，分析GEO数据集
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC分离 | 淋巴细胞分离液 | STEMCELL | 07861 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10099141C |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher | 21985023 | |
| BMDM培养 | 小鼠巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-02 |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素溶液 | Beyotime | C0222 |
| 质粒转染 | RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778150 |
| Jetprime转染试剂 | Polyplus Transfection | 101000046 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Genomeditech | GM-040901 |
| 细胞刺激 | 白细胞介素-1β | PeproTech | 211-11B |
| 肿瘤坏死因子α | Sigma-Aldrich | 654245 | |
| 白细胞介素-6 | PeproTech | 216-16 | |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma-Aldrich | P1530 | |
| 核质分离 | NE-PER核质提取试剂 | Thermo Fisher | 78833 |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Fastagen | 220011 |
| RT-qPCR | HiScript III第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R312 |
| ChamQ SYBR定量PCR预混液 | Vazyme | Q331 | |
| Western blot | 抗小鼠HRP二抗 | CST | 7076 |
| 抗兔HRP二抗 | CST | 7074 | |
| 免疫荧光 | 抗RRP1抗体 | GeneTex | GTX115107 |
| 抗NNP1抗体 | Santa Cruz | sc-398970 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4412 | |
| Alexa Fluor 488标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 4408 | |
| Alexa Fluor 568标记抗小鼠IgG | Abcam | ab175473 | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime | P0131 | |
| 细胞死亡检测 | 绿色核酸染料 | Invitrogen | S7020 |
| RIP | 蛋白A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 |
| TRIzol LS试剂 | Thermo Fisher | 10296028 | |
| GRPIp | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 |
| GRPIp质控 | Agilent Infinity 1260液相色谱系统 | Agilent | -- |
| 300SB-C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| GRPIp | 硅胶柱 | Qiagen | 163032371 |
| 4D质谱 | Bruker timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- |
| 体外RNA结合分析 | 硅胶柱 | Zymo | R1016 |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SPR | T7 RNA聚合酶 | NEB | 2050 |
| 生物素RNA标记混合物 | Roche | 11685597910 | |
| Biacore 1K系统 | Cytiva | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab222503 |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab197742 | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab46052 | |
| SAM ELISA试剂盒 | Meimian | MM-43942M1 | |
| 甲硫氨酸ELISA试剂盒 | Meimian | MM-45354M1 | |
| 四氢叶酸ELISA试剂盒 | Meimian | MM-927831O1 | |
| 碳示踪 | L-丝氨酸-[13C3] | MCE | HY-N0650S |
| 代谢组学 | Pegasus HT气相色谱-飞行时间质谱 | -- | -- |
| Agilent 7890B气相色谱仪 | Agilent | -- | |
| Gerstel MPS2多功能进样器 | Gerstel | -- | |
| 靶向代谢组学 | ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S液质联用系统 | Waters | -- |
| 新生RNA捕获 | 5-乙基尿苷 | MCE | HY-141140 |
| N-(3-叠氮丙基)生物素酰胺 | MCE | HY-129832 | |
| seCLIP | T4 RNA连接酶 | NEB | M0202 |
| Superscript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080044 | |
| 动物实验 | 雷替曲塞 | MCE | HY-10821 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GRPIp筛选 | UV交联剂量200 mJ/cm2、BMDM数量≥1×10^9/时间点、IL-1β刺激0/1/12 h分组 阅读提示：Methods中Global RNA-protein Interactome purification (GRPIp)小节及Fig. 1a |
| 细胞刺激与炎症因子检测 | IL-1β 50 ng/ml、TNFα 10 ng/ml、IL-6 20 ng/ml、LPS 100 ng/ml、poly(I:C) 100 μg/ml及刺激时间 阅读提示：Methods中RNAi, plasmids, and lentivirus transfection小节与各Figure legends |
| RRP1缺失与过表达 | RAW 264.7 CRISPR-Cas9 sgRNA序列、siRNA 20 nM、过表达结构域（FL/Nop52/Cter） 阅读提示：Methods中Mice, cells and reagents及RNAi小节；Supplementary Table 1、3 |
| 代谢组与同位素示踪 | L-serine-[13C3] 10 μM预标记2 h、IL-1β刺激4 h、每组n=4；靶向代谢组n=5或3 阅读提示：Methods中Carbon-tracing experiments与Metabolomics analysis小节；Fig. 4 legends |
| CAIA模型与药物干预 | 9周龄小鼠、mAb cocktail 2 mg/只第0天、LPS 30 μg第3和10天、Raltitrexed 10 mg/kg第5和7天、每组n=10或5 阅读提示：Methods中Collagen antibody-induced arthritis (CAIA) model小节；Fig. 7 legends |
| RA患者样本分析 | PBMC分离方法、患者纳入标准、n=50、按RRP1 mRNA中位数分组 阅读提示：Methods中PBMCs from rheumatoid arthritis patients小节；Fig. 7i–k legends |