小鼠心脏发育中mTOR信号动态分析
验证mTOR信号是否随心脏成熟而下调
回顾性分析公共转录组数据，Western blot检测E12、E18、P7心脏中pAKT、pS6K、p4E-BP1、p27，免疫荧光检测ZO-1/WT1，并培养E12心外膜外植体检测mTOR靶点变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过抑制mTOR信号从人诱导多能干细胞生成成熟心外膜
Generation of mature epicardium derived from human-induced pluripotent stem cells via inhibition of mTOR signaling.
实验完整度
高包含小鼠体内心外膜、hiPSC来源心外膜单层、心脏类器官及单细胞测序等多层级证据，并进行了功能与机制验证。
主要模型
hiPSC来源心外膜细胞单层（409B2、1390C1细胞系） 小鼠胚胎心外膜外植体及E12-E18心脏 hiPSC来源心脏类器官（hHOs） hiPSC来源心室心肌细胞与心外膜共培养体系
重点核对
Torin1处理浓度200 nM、处理时间7天（心外膜单层）或24小时（小鼠胚胎心脏） hiPSC心外膜分化方案：409B2使用10 µM SB431542维持；1390C1使用rhBMP4、Activin A、CHIR、Retinol等分阶段诱导 小鼠胚胎心脏取材时间点E12、E14、E18及出生后P7 心脏类器官Torin1处理从day 15开始持续7天，浓度200 nM 高内涵筛选化合物浓度1 µM，处理2天后检测MKI67
摘要
在心脏损伤后重新激活人心外膜有望促进心脏组织再生。尽管已有成功的分化方案能够从诱导多能干细胞（iPSCs）产生纯的、自我更新的心外膜细胞，但这些细胞仍保持胚胎期增殖状态，阻碍了对成年心外膜再激活的研究。我们介绍一种优化方法，在胚胎心外膜中抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号，诱导静止状态，从而增强多步骤心外膜成熟。这产生了功能成熟的心外膜，可用于模拟成年心外膜再激活。此外，我们评估了包含心肌细胞和成熟心外膜的心脏类器官，探究心脏成熟过程中心外膜静止的分子机制。我们的结果突显了iPSC来源的成熟心外膜在研究成年心外膜再激活方面的潜力，这对有效的心脏再生至关重要。此外，心脏类器官模型为心脏发育和再生中复杂的心肌细胞-心外膜相互作用提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过抑制mTOR信号在体外诱导hiPSC来源心外膜进入静止状态并促进其功能成熟，从而建立模拟成年心外膜再激活的细胞平台？
- 核心机制
- 双重抑制mTORC1/2（而非仅抑制mTORC1）通过降低pAKT和pS6K，诱导心外膜细胞周期退出和静止，并依赖YBX3和MAFF等转录因子抑制胚胎心外膜程序，促进功能成熟。
- 主要证据
- 小鼠胚胎心脏及心外膜外植体中mTOR信号随发育下调；Torin1处理hiPSC心外膜单层导致G0期细胞从14.2%增至82.5%，WT1/TBX18表达下降，MSLN升高，迁移能力丧失；RNA-seq显示Torin1处理组转录组靠近成年心外膜；心脏类器官中Torin1处理增加成熟心肌和心外膜标志物并出现内皮细胞群。
- 研究意义
- 建立了一个可用于高通量筛选的hiPSC来源成熟心外膜平台，并证明mTOR抑制可促进心脏类器官成熟，为研究成年心外膜再激活和心脏再生提供工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Torin1处理促进小鼠胚胎心外膜成熟
检验mTOR化学抑制能否在离体水平加速心外膜成熟
E12心脏经Torin1处理后检测WT1、pS6K、pAKT、TNNI3等蛋白；心外膜外植体经Torin1处理7天后检测mTOR靶点和WT1，并进行RNA-seq与成年心外膜比较。
hiPSC来源心外膜的分化与mTORC1/2抑制
在人类细胞体系中验证mTOR抑制对心外膜静止和成熟的作用
从409B2和1390C1 hiPSC系分化心外膜细胞，day 24起用Torin1处理7天，检测增殖、凋亡、EMT、细胞周期和转录组变化，并与原代成人心外膜数据集比较。
高通量筛选再激活成熟心外膜的化合物
评估成熟心外膜平台是否可用于筛选促再激活化合物
对Torin1诱导成熟的hiPSC心外膜进行约1600种生物活性化合物的高通量筛选，以MKI67表达细胞数和强度为指标，鉴定活性化合物类别。
YBX3和MAFF在mTORC2依赖的心外膜成熟中的作用
验证mTORC2下游转录因子对心外膜成熟的因果贡献
比较Rapamycin、Torin1和JR-AB2-011处理后的转录组差异，筛选mTORC2响应转录因子，并用siRNA敲低YBX3和MAFF后检测WT1、TBX18、MKI67和C3表达。
成熟心外膜通过旁分泌促进心肌细胞成熟
检验成熟心外膜是否通过IGF2和FN1旁分泌信号促进hiPSC心肌细胞转录成熟
将Torin1处理的成熟心外膜与hiPSC来源心室肌细胞类胚体共培养10天，检测TNNI3/TNNI1表达及左室致密化相关基因，并用IGF2中和抗体阻断验证。
mTOR抑制生成成熟心脏类器官
在更接近体内发育的多细胞环境中验证mTOR抑制对心外膜和心肌成熟的效应
从1390C1 hiPSC系经三步Wnt调控生成自组装心脏类器官，day 15起Torin1处理7天，检测类器官大小、WT1、TNNI3、SNAI1表达，并进行单细胞RNA-seq分析细胞组成和成熟标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 灵长类胚胎干细胞培养基 | ReproCELL | -- |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| StemFit® AK02N培养基 | ReproCELL | -- | |
| iMatrix-511 | Nippi | -- | |
| 心外膜分化 | SB431542 | -- | -- |
| 重组人骨形态发生蛋白4 | -- | -- | |
| 激活素A | -- | -- | |
| CHIR | -- | -- | |
| 视黄醇 | Sigma | -- | |
| 心肌细胞分化 | TrypLE select | Gibco | -- |
| StemPro-34培养基 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 单硫代甘油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转铁蛋白 | Wako | -- | |
| ROCK抑制剂Y-27632 | Nacalai | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 血管内皮生长因子 | R&D Systems | -- | |
| IWP-3 | ReproCELL | -- | |
| mTOR抑制处理 | Torin1 | -- | -- |
| 雷帕霉素 | -- | -- | |
| 他克莫司 | -- | -- | |
| JR-AB2-011 | -- | -- | |
| 细胞增殖抑制 | 帕博西尼 | -- | -- |
| 中和抗体处理 | IGF2中和抗体 | R&D | MAB292 |
| siRNA转染 | Silencer® Select siRNA siYBX3 | ThermoFisher | s16222 |
| Silencer® Select siRNA siMAFF | ThermoFisher | s24372 | |
| RNAiMax转染试剂 | ThermoFisher | -- | |
| 免疫荧光染色 | 抗WT1抗体 | Abcam | ab89901 |
| 抗ZO-1抗体 | Invitrogen | 33-9100 | |
| 抗MSLN抗体 | Abcam | ab93620 | |
| 抗C3抗体 | Abcam | ab97462 | |
| 抗Caspase-3抗体 | R&D | AF835 | |
| 免疫细胞化学 | 抗TBX18抗体 | Abcam | ab15262 |
| 抗pH3抗体 | CST | C36B11 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 抗SNAI抗体 | CST | 3879 | |
| 抗SNAI2抗体 | CST | 9585 | |
| 免疫荧光染色 | 山羊抗小鼠488 | Invitrogen | A11001 |
| 山羊抗兔647 | Invitrogen | A21245 | |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| 抗心肌肌钙蛋白T抗体 | Abcam | ab8295 | |
| 抗TNNI3抗体 | Abcam | ab10231 | |
| 驴抗小鼠488 | Invitrogen | A21202 | |
| 驴抗兔594 | Invitrogen | A21207 | |
| 流式细胞术 | 抗WT1抗体 | Abcam | ab89901 |
| 抗TNNT2抗体 | BD | 565744 | |
| 抗CD31抗体 | BioLegend | 303116 | |
| 抗CD90抗体 | BD | 559869 | |
| 山羊抗兔647 | Invitrogen | A21245 | |
| Western blot | 抗磷酸化S6核糖体蛋白抗体 | CST | 5364 |
| 抗磷酸化4E-BP1抗体 | CST | 2855 | |
| 抗4E-BP1抗体 | CST | 9644 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | CST | 9271 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma | A5441 | |
| 抗WT1抗体 | Abcam | ab89901 | |
| 抗cTnI TNNI3抗体 | Abcam | ab10231 | |
| 抗SNAI1抗体 | Abcam | ab63371 | |
| 抗NBL1抗体 | Abcam | ab174843 | |
| 抗p53抗体 | CST | 12790S | |
| 抗p16抗体 | CST | 12D1 | |
| 抗p21抗体 | CST | D7C1M | |
| 抗TBX18抗体 | Abcam | ab15262 | |
| 抗KI67抗体 | Biolegend | 350502 | |
| 抗p27抗体 | CST | 3686 | |
| 抗TNNI1抗体 | Abcam | ab203515 | |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG | Santa Cruz | sc-2054 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG | CST | 7076 | |
| 侵袭实验 | BioCoat Matrigel侵袭小室 | Corning | 354480 |
| 衰老检测 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling TECHNOLOGY | 9860 |
| ELISA | 人IGF-II/IGF2 ELISA试剂盒 | R&D | DG200 |
| 蛋白提取 | M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78501 |
| T-PER组织蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78510 | |
| RNA提取 | QIAzol®裂解试剂 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | ReverTra Ace系统 | Toyobo BIOTECH | -- |
| RT-qPCR | Next SYBR® qPCR混合液 | Thunderbird | -- |
| 高通量筛选 | PhenoPlate 384孔微板 | PerkinElmer | -- |
| 单细胞RNA测序 | Chromium GEM-X单细胞3’试剂盒v4 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | nanoElute 2液相色谱系统 | Bruker | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| C18色谱柱 | IonOpticks | 250 mm × 75 µm, 1.6 µm |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPSC心外膜分化与成熟 | hiPSC细胞系（409B2或1390C1）及对应的分化小分子阶段和浓度；Torin1处理浓度200 nM、处理7天；SB431542维持浓度（409B2为10 µM，1390C1为6 µM） 阅读提示：Methods中“Epicardial differentiation from hiPSCs”及Results中“Dual inhibition of mTORC1/2 enhances epicardial quiescence and maturation in hiPSC-derived epicardium” |
| 小鼠胚胎心外膜外植体培养与Torin1处理 | 小鼠胚胎取材时间点E12/E14/E18；外植体培养基为DMEM低糖+15% FBS；Torin1处理浓度200 nM、时间24小时（完整心脏）或7天（外植体）；SB431542添加时机 阅读提示：Methods中“Expansion of epicardial explants ex vivo”及Figure 2图注 |
| 心脏类器官生成与Torin1处理 | hiPSC系1390C1；三步Wnt调控分化方案；Torin1从day 15起处理7天、浓度200 nM；hHOs中WT1+和TNNT2+细胞比例 阅读提示：Methods中“Heart organoid induction from hiPSCs”及Results中“Generation of mature iPSC-derived heart organoids with quiescent epicardium”及Figure 7图注 |
| 高通量筛选 | 细胞接种密度1500细胞/孔（384孔板）；Torin1预处理的浓度和时间；化合物终浓度1 µM；处理2天后MKI67免疫细胞化学检测；阳性阈值设定 阅读提示：Methods中“High throughput screening”及Supplementary Fig. 6 |
| siRNA敲低实验 | siRNA浓度10 µM；转染试剂RNAiMax用量；细胞数量50,000；siYBX3和siMAFF的ID 阅读提示：Methods中“Cell transfection”及Figure 5图注 |
| 共培养与旁分泌验证 | 共培养天数10天；IGF2中和抗体浓度2 µg/mL；ELISA试剂盒及 normalized by cell number；心肌细胞分化方案 阅读提示：Methods中“Cardiomyocyte differentiation from hiPSCs”及“ELISA”及Figure 6图注 |