脂肪细胞特异性Zeb1基因修饰小鼠的建立与乳腺脂肪发育表型分析
验证Zeb1在乳腺脂肪生成和脂肪细胞分化中的作用。
将Zeb1fl/fl小鼠与Fabp4-Cre小鼠杂交获得Zeb1adiKO小鼠，将B6-CAG-LSL-Zeb1与Fabp4-Cre杂交获得Zeb1adiTG小鼠；通过RT-PCR和免疫组化验证Zeb1表达，检测乳腺脂肪垫重量、HE染色、Perilipin-1免疫染色及Pref1、Ppar-γ、C/ebpα表达。
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脂肪细胞特异性Zeb1下调重塑肿瘤相关脂肪微环境以促进女性乳腺癌进展
Adipocyte-specific Zeb1 downregulation remodels the tumor-associated adipose microenvironment to facilitate female breast cancer progression.
实验完整度
高包含脂肪细胞特异性基因敲除/敲入小鼠、细胞共培养、单核RNA测序、脂质组学、代谢组学及体内移植瘤和肺转移模型，并有功能与机制验证。
主要模型
Zeb1adiKO与Zeb1adiTG脂肪细胞特异性基因修饰小鼠 EO771小鼠乳腺癌细胞与MDA-MB-231人乳腺癌细胞 3T3-L1分化脂肪细胞及与癌细胞共培养建立的CAAs MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠及40例乳腺癌患者组织样本
重点核对
Zeb1adiKO小鼠中脂肪组织Zeb1表达下调，乳腺脂肪垫重量减轻，脂肪细胞变小且多房脂滴 CAAZeb1-off与CAAZeb1-on条件培养基处理EO771细胞后检测EdU增殖、transwell侵袭和高内涵迁移 CAAZeb1-on细胞中Atgl、Hsl、Mgl、Scd的mRNA和蛋白水平降低，Scd启动子E2-box依赖的Zeb1结合 POA（5 μM）和OA（15 μM）处理EO771细胞48 h后检测增殖、侵袭和迁移 EO771同种移植瘤模型中A939572（30 mg/kg，每2天一次）与AMA（5 μg/天）单用或联用的肿瘤体积和重量
摘要
乳腺癌细胞穿透基底膜后直接与周围脂肪组织相互作用，形成独特的肿瘤相关脂肪微环境（TAME）。然而，TAME中脂质代谢重塑的潜在机制仍不清楚。在此，我们报道了Zeb1协调的乳腺癌细胞与其邻近癌相关脂肪细胞（CAAs）之间的双向通讯。在分子层面，乳腺癌细胞通过分泌肾上腺髓质素（AM）诱导CAAs中Zeb1表达下调，从而激活Atgl/Hsl/Scd依赖性脂解，导致棕榈油酸（POA）释放到TAME中。反过来，乳腺癌中增加的POA与花生四烯酸（ARA）竞争磷脂合成，使得更多ARA用于PDG2产生，从而触发乳腺癌恶性进展和AM产生。重要的是，破坏TAME中Zeb1依赖性脂解活性和/或膜磷脂重塑可显著降低乳腺癌在体外和体内的侵袭性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳腺癌细胞与邻近癌相关脂肪细胞之间如何通过脂质代谢重塑肿瘤相关脂肪微环境并促进乳腺癌进展。
- 核心机制
- 乳腺癌细胞分泌AM诱导CAAs中Zeb1下调，激活Atgl/Hsl/Scd依赖性脂解并释放POA；POA进入癌细胞后竞争性置换膜磷脂sn-2位ARA，增加PGD2产生，进而通过cAMP/PKA/Creb1促进AM分泌，形成正反馈环路。
- 主要证据
- 脂肪细胞特异性Zeb1敲除/敲入小鼠、3T3-L1与癌细胞共培养、单核RNA测序、脂质组学和代谢组学、启动子荧光素酶与ChIP实验，以及EO771/PyMT同种移植瘤和实验性肺转移模型。
- 研究意义
- 揭示Zeb1在乳腺癌细胞与脂肪细胞双向通讯中的作用，提示靶向脂肪细胞特异性Zeb1/Scd/AM轴可能为乳腺癌治疗提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
乳腺组织单核RNA测序分析Zeb1缺失后的细胞组成和脂肪细胞亚群
解析脂肪细胞Zeb1缺失对乳腺细胞组成、脂肪细胞亚群和脂质代谢基因表达的影响。
对Zeb1fl/fl和Zeb1adiKO小鼠乳腺组织进行单核RNA测序，t-SNE聚类注释细胞类型和脂肪细胞亚群，分析拟时序轨迹、通路富集和脂质代谢相关基因表达。
CAAs中Zeb1表达检测及体外共培养CAAs模型建立
验证乳腺癌相关脂肪细胞中Zeb1表达变化，并建立可调控Zeb1表达的CAAs共培养体系。
对MMTV-PyMT小鼠肿瘤浸润前沿CAAs和40例乳腺癌患者CAAs进行Zeb1免疫组化；将3T3-L1分化脂肪细胞与EO771细胞共培养获得3T3CAA细胞；利用Tet-on系统构建DOX诱导Zeb1表达的3T3Zeb1-Tet细胞，与EO771共培养建立CAAZeb1-off和CAAZeb1-on细胞。
Zeb1调控CAAs脂解及对乳腺癌细胞恶性表型的旁分泌作用
验证CAAs中Zeb1表达变化对脂解和乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT的影响。
对CAAZeb1-off和CAAZeb1-on细胞进行Oil Red O和Bodipy-C16染色；收集条件培养基处理EO771和MDA-MB-231细胞，检测EdU增殖、transwell侵袭、高内涵迁移及Snail、Vimentin蛋白表达。
脂肪细胞特异性Zeb1对乳腺癌体内生长和肺转移的影响
在体内验证脂肪细胞Zeb1表达变化对乳腺癌原发瘤生长、CAAs脂解和肺转移的作用。
将EO771或PyMT细胞注射到Zeb1TG和Zeb1adiTG小鼠第四乳腺脂肪垫建立同种移植瘤模型，检测肿瘤体积、重量、HE和Perilipin-1染色、Ki67和Vimentin免疫组化；用CAAZeb1-off/on条件培养基预处理的EO771或PyMT细胞经尾静脉注射建立实验性肺转移模型。
Zeb1下游脂质代谢靶点的鉴定及Scd转录调控验证
鉴定Zeb1调控CAAs脂质代谢的关键酶和直接转录靶点。
对CAAZeb1-off和CAAZeb1-on细胞进行非靶向脂质组学、中长链脂肪酸靶向代谢组学和RNA测序；检测Atgl、Hsl、Mgl、Scd的mRNA、蛋白和酶活性；构建Atgl、Hsl、Mgl、Scd启动子荧光素酶报告基因，进行Scd启动子E2-box突变和ChIP-qPCR。
POA对乳腺癌细胞膜磷脂重塑和ARA/PGD2代谢的影响
验证POA进入乳腺癌细胞后通过膜磷脂sn-2位置换ARA并促进PGD2产生。
用POA和OA处理EO771和MDA-MB-231细胞，检测增殖、侵袭、迁移；进行靶向脂质组学分析含C16:1或C20:4的膜磷脂；RNA测序和GSEA分析ARA代谢；靶向代谢组学检测ARA及其代谢物；用AT-56抑制Ptgds。
POA-PGD2-AM反馈环及AM/AMR对脂肪细胞Zeb1和脂解的影响
验证POA通过PGD2-cAMP/PKA-Creb1促进AM分泌，AM通过AMR下调脂肪细胞Zeb1并诱导脂解。
用POA和AT-56处理EO771细胞，收集条件培养基处理3T3Adi细胞；检测AM表达和分泌；用PGD2、SQ22536、Creb1敲低验证cAMP/PKA/Creb1通路；用AM、AMA和CRLR敲低处理3T3Adi细胞，检测脂解和Zeb1表达；利用癌细胞-脂肪细胞共培养模型验证。
靶向Zeb1/Scd/AM轴和ARA/PGD2/AM轴的体内联合治疗验证
验证联合抑制Scd和AMR或联合抑制AMR和Ptgds对乳腺癌同种移植瘤的治疗效果。
建立EO771乳腺脂肪垫同种移植瘤模型，腹腔注射A939572与AMA单用或联用，或AT-56与AMA单用或联用；检测肿瘤体积、重量、HE染色、Zeb1、Ki67、Vimentin免疫组化及小鼠体重。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Servicebio | G4515 |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001-500 | |
| 青霉素/链霉素 | Servicebio | G4003 | |
| 脂肪细胞分化 | 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I2643 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Macklin | I811775 | |
| 油红O染色 | 油红O染色试剂盒 | Beyotime | C0158s |
| 小鼠乳腺全组织染色 | 卡红明矾溶液 | Sigma-Aldrich | 1390-65-4 |
| BODIPY-C16摄取 | BODIPY-C16荧光探针 | Thermofisher | D3821 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | YEASEN | 10606ES60 |
| RT-qPCR | 逆转录酶 | Yeasen | 11300ES92 |
| SYBR Green定量PCR预混试剂盒 | Yeasen | 11201ES03 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Yeasen | 20115ES60 |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Yeasen | 20201ES76 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Yeasen | 36208ES76 | |
| 药物处理 | 棕榈油酸 | Glpbio | GC31253 |
| 油酸 | Glpbio | GC30110 | |
| 乙莫克舍 | TargetMol | T4535 | |
| A939572 | TargetMol | T4515 | |
| SQ22536 | TargetMol | 17318-31-9 | |
| AT-56 | Macklin | A872100 | |
| 前列腺素D2 | Macklin | P923874 | |
| 人重组肾上腺髓质素 | Glpbio | GC35258 | |
| 肾上腺髓质素受体拮抗剂 | Glpbio | GC32615 | |
| ChIP | EZ-ChIP试剂盒 | Millipore | 17-371FR |
| 荧光素酶实验 | 双荧光素酶报告分析系统 | Promega | J3082 |
| EdU增殖检测 | EdU | RiboBio | C10310-1 |
| 细胞活力检测 | CCK8细胞活力检测试剂盒 | Yeasen | 40203ES88 |
| Transwell侵袭实验 | 基质胶 | Yeasen | 40183ES08 |
| Transwell小室 | Falcon | 3464 | |
| 肺转移检测 | 印度墨汁 | Solarbio | I8060 |
| 细胞核分离 | GEXSCOPE®细胞核分离液 | Singleron Biotechnologies | -- |
| 单核RNA测序 | GEXSCOPE®单核RNA测序试剂盒 | Singleron Biotechnologies | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记二抗 | zSBG-BIO | ZF-0511 |
| Alexa Fluor 594标记二抗 | zSBG-BIO | ZF-0516 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| ELISA | 小鼠肾上腺髓质素ELISA试剂盒 | Senbeijia | SBJ-M0203 |
| Western blot | 抗Zeb1抗体 | Proteintech | 21544-1-AP |
| 免疫组化 | 抗Zeb1抗体 | abcam | ab87280 |
| Western blot | 抗Crlr抗体 | SAB | 37509 |
| 抗Creb1抗体 | Proteintech | 12208-1-AP | |
| 免疫组化和Western blot | 抗Scd抗体 | SAB | 37896 |
| 抗Ptgds抗体 | SAB | 31107 | |
| 免疫荧光 | 抗Perilipin-1抗体 | Genetex | GTX634406 |
| 免疫组化和Western blot | 抗Vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 |
| Western blot | 抗Snail抗体 | Proteintech | 13099-1-AP |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Servicebio | GB151142 |
| Western blot | 抗actin抗体 | Santa Cruz | sc-47778 |
| 抗Atgl抗体 | Santa Cruz | sc-365278 | |
| 抗Hsl抗体 | SAB | 41039 | |
| 抗Mgl抗体 | Santa Cruz | sc-398942 | |
| 脂质组学 | CSH C18色谱柱 | Waters | -- |
| 靶向脂质组学 | Nexera LC-30A超高效液相色谱系统 | Shimadzu | -- |
| QTRAP 6500+质谱仪 | Sciex | -- | |
| 中长链脂肪酸靶向代谢组学 | 5977B MSD质谱仪 | Agilent | -- |
| ARA靶向代谢组学 | 5500 QTRAP质谱仪 | SCIEX | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 脂肪细胞特异性Zeb1基因修饰小鼠 | 基因型Fabp4-Cre+; Zeb1fl/fl或Fabp4-Cre+; Zeb1+/+，小鼠性别和周龄，每组样本量n=5 阅读提示：Methods: Mice and mice housing；Fig. 1a和图注 |
| 3T3-L1脂肪细胞分化 | 分化诱导液含5 μg/mL胰岛素、1 μM地塞米松、1 mM罗格列酮、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤处理2天，之后5 μg/mL胰岛素维持 阅读提示：Methods: Mature adipocyte generation in vitro and Oil Red O staining |
| 癌细胞与脂肪细胞共培养及条件培养基 | transwell孔径0.4 μm，共培养6天；条件培养基用0.2% FBS DMEM收集24 h并经0.22 μm过滤 阅读提示：Methods: Cell co-culture and conditioned medium (CM) production |
| CAAs中Zeb1调控的脂解与Scd靶点验证 | DOX诱导Tet-on Zeb1表达的浓度和时间；A939572使用100 nM处理6天；启动子片段位置Atgl −2960/+99、Hsl −3000/+8、Mgl −2997/+103、Scd −2746/+300 阅读提示：Fig. 2c–e、Fig. 5i–l及图注；Methods: Plasmid construction |
| POA和OA处理乳腺癌细胞 | POA 5 μM、OA 15 μM处理48 h；AT-56 50 μM；检测增殖、侵袭和迁移的终点 阅读提示：Fig. 6a–c、Fig. 6k–m图注 |
| EO771乳腺脂肪垫同种移植瘤及药物处理 | 8周龄雌性C57BL/6小鼠，每只注射50 μL 1000万细胞/mL细胞悬液加25 μL Matrigel；A939572 30 mg/kg每2天一次，AMA 5 μg/天，AT-56 50 mg/kg每2天一次，处理3周；每组n=6 阅读提示：Methods: Tumor cell implantation；Fig. 8a和图注；Supplementary Fig. 14a |
| 实验性肺转移模型 | EO771或PyMT细胞经条件培养基预处理4天，尾静脉注射50 μL 1000万细胞/mL，30天后检测肺转移；每组n=5 阅读提示：Methods: Experimental lung metastasis model of breast cancer；Fig. 4a、f图注 |