建立αPD1诱导心脏毒性小鼠模型并评估Lef保护作用
验证Lef是否减轻αPD1诱导的心脏毒性且不影响抗肿瘤疗效。
B16-F10细胞皮下移植构建黑色素瘤荷瘤小鼠，给予αPD1和Lef，通过超声心动图、血浆cTnT和CK-MB、HE和Masson染色评估心脏功能与损伤，并测量肿瘤体积。
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微生物群-吲哚-3-丙酸-心脏轴介导来氟米特对小鼠αPD1诱导的心脏毒性的保护作用
Microbiota-indole-3-propionic acid-heart axis mediates the protection of leflunomide against αPD1-induced cardiotoxicity in mice.
实验完整度
高含小鼠肿瘤模型、心脏功能评估、FMT、16S rRNA测序、代谢组学、细胞实验及机制验证
主要模型
B16-F10黑色素瘤荷瘤C57BL/6小鼠 αPD1处理荷瘤小鼠心脏毒性模型 成年小鼠原代心肌细胞
重点核对
αPD1腹腔注射250 μg/kg，隔日一次；Lef每日10 mg/kg，处理12天 CD8+ T细胞清除实验使用αCD8抗体400 μg腹腔注射，隔日一次 粪菌移植：供体为αPD1或αPD1+Lef小鼠粪便，受体为αPD1小鼠，每只200 μL灌胃 IPA灌胃40 mg/kg，持续2周 心脏AhR敲低：尾静脉注射1×10^11病毒基因组AAV9-shAhR，3周后给予αPD1
摘要
抗程序性死亡1（αPD1）免疫检查点阻断用于癌症联合治疗，但与心血管毒性相关。来氟米特（Lef）可抑制多种肿瘤生长并减轻小鼠心脏重构。然而，Lef在αPD1诱导的心脏毒性中的作用尚不清楚。在此，我们报道Lef治疗可抑制αPD1相关心脏毒性，且不损害αPD1介导的免疫治疗疗效。Lef改变了αPD1处理的黑色素瘤荷瘤小鼠的肠道微生物群落结构。此外，接受来自Lef+αPD1处理的黑色素瘤荷瘤小鼠微生物群移植的小鼠，与接受αPD1处理小鼠移植的小鼠相比，心脏功能更好。机制上，我们分析代谢组学并鉴定出吲哚-3-丙酸（IPA），其可保护αPD1处理小鼠的心脏功能障碍。IPA可直接结合芳香烃受体并促进磷脂酰肌醇3-激酶表达，从而削弱心肌细胞对免疫损伤的反应。我们的发现揭示，Lef通过调节微生物群-IPA-心脏轴减轻黑色素瘤荷瘤小鼠中αPD1诱导的心脏毒性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 来氟米特能否减轻αPD1诱导的心脏毒性，且其保护作用是否不依赖CD8+ T细胞并涉及肠道微生物群-IPA-心脏AhR轴。
- 核心机制
- Lef改变肠道微生物群，增加IPA生成；IPA直接结合心脏AhR并促进PI3K催化亚基α转录，激活PI3K-AKT-GSK3β通路，抑制心肌细胞凋亡，从而减轻αPD1诱导的心脏毒性。
- 主要证据
- 在B16-F10荷瘤小鼠中，Lef改善αPD1处理小鼠的EF、FS和GLS，降低cTnT和CK-MB，减少心脏凋亡；FMT实验显示Lef+αPD1粪便可改善心脏功能；代谢组学联合16S rRNA分析鉴定IPA；IPA灌胃保护心脏功能；shAhR和shPI3K实验及ChIP-PCR证实AhR-PI3K通路。
- 研究意义
- 揭示Lef通过微生物群-IPA-心脏AhR轴保护αPD1诱导的心脏毒性，为接受免疫检查点抑制剂治疗患者的心脏毒性提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Lef的心脏保护作用是否依赖CD8+ T细胞或对心肌细胞的直接作用
明确Lef保护作用是否通过抑制CD8+ T细胞或直接作用于心肌细胞。
使用CD8抗体清除CD8+ T细胞后评估Lef对心脏功能的影响；分离成年小鼠心肌细胞，给予Lef活性代谢物A77 1726，检测细胞活力。
评估Lef对肠道屏障和肠道微生物群的影响
探究Lef的心脏保护作用是否与肠道屏障和肠道微生物群相关。
检测结肠长度、小肠组织学、紧密连接蛋白表达；进行16S rRNA测序分析粪便微生物组成；通过粪菌移植评估微生物群对心脏功能的影响。
代谢组学筛选并验证Lef保护作用的关键代谢物IPA
鉴定介导Lef心脏保护作用的具体微生物代谢物。
对血浆进行非靶向LC-MS/MS代谢组学分析，结合16S rRNA数据筛选关键代谢物；通过色氨酸缺乏饮食和IPA灌胃验证IPA的作用。
验证IPA通过心脏AhR受体发挥保护作用
明确IPA的心脏保护作用是否依赖AhR。
检测AhR及其靶基因CYP1A1表达；使用AAV9-shAhR敲低心脏AhR，评估IPA对心脏功能的影响；在离体心肌细胞中使用AhR抑制剂CH223191、PXR抑制剂resveratrol和TLR4抑制剂IAXO-102。
验证AhR直接转录调控PI3K并评估PI3K在IPA保护中的作用
揭示IPA-AhR下游的PI3K-AKT通路机制。
分析RNA-seq数据中PI3K-AKT通路；通过ChIP-PCR检测AhR与PI3K催化亚基α启动子的结合；检测PI3K、p-AKT、p-GSK3β表达；在离体心肌细胞中敲低PI3K并评估IPA对细胞活力的保护作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 抗PD1抗体 | BioXCell | RMP 1-14 |
| 同型对照抗体 | BioXCell | BE0083 | |
| 来氟米特 | Sigma | 75706 | |
| CD8抗体 | BioXCell | BE0118 | |
| 细胞培养 | A77 1726 | Sigma-Aldrich | SML0936 |
| CH223191 | MedChemExpress | HY-12684 | |
| 白藜芦醇 | MedChemExpress | HY-16561 | |
| IAXO-102 | MedChemExpress | HY-125171 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875119 | |
| CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0038 | |
| Western blot | 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 2772 |
| 抗Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 3498 | |
| 抗occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP | |
| 抗ZO-1抗体 | Abmart | TA5145 | |
| 抗AhR抗体 | Cell Signaling Technology | 83200 | |
| 抗细胞色素P450 1A1抗体 | Cell Signaling Technology | 94004 | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | Proteintech | 27921-1-AP | |
| 抗PI3K抗体 | Proteintech | 20662-1-AP | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化GSK抗体 | Cell Signaling Technology | 9323 | |
| 抗GSK-3β抗体 | Cell Signaling Technology | 12456 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11852700 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906837001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Invitrogen | 23227 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPFL00010 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | Roche Diagnostics | 04896866001 | |
| SYBR Green PCR试剂盒 | Roche | 04707516001 | |
| 免疫荧光 | 抗CD4抗体 | Abcam | ab133616 |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab217344 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG二抗 | Invitrogen | A21206 | |
| DAPI | Invitrogen | S36939 | |
| 流式细胞术 | APC-Cy7大鼠抗小鼠CD45抗体 | BD Pharmingen | 57659 |
| PE-Cy7大鼠抗小鼠CD8a抗体 | BD Pharmingen | 552877 | |
| APC标记抗小鼠CD3e抗体 | BD Pharmingen | 553066 | |
| PE大鼠抗小鼠CD4抗体 | BD Pharmingen | 553048 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 组织学 | Masson三色染色试剂盒 | Servicebio | G1006 |
| 生化分析 | cTnT和CK-MB检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 16S rRNA测序 | TIANamp细菌DNA提取试剂盒 | Tiangen Biochemical Technology | -- |
| ChIP-PCR | Upstate EZ ChIP试剂盒 | Upstate Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| αPD1诱导心脏毒性小鼠模型构建与Lef处理 | B16-F10细胞接种数量2.5×10^5个/只；αPD1剂量250 μg/kg隔日腹腔注射；Lef剂量10 mg/kg每日一次处理12天；αPD1组n=20 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Fig. 1A图注 |
| CD8+ T细胞清除实验 | αCD8抗体剂量400 μg/只，隔日腹腔注射；清除效果验证方法 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Supplementary Fig. 4 |
| 粪菌移植 | 受体小鼠抗生素处理方案（万古霉素0.5 g/L、新霉素硫酸盐0.5 g/L、嘌呤0.5 g/L饮水1周）；供体粪便1 g/10 mL PBS；每只灌胃200 μL 阅读提示：Methods中Fecal microbial transplantation小节及Fig. 4A图注 |
| IPA灌胃处理 | IPA剂量40 mg/kg，灌胃2周 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Fig. 6I图注 |
| 心脏AhR敲低 | AAV9-shAhR剂量1×10^11病毒基因组/只尾静脉注射；注射3周后给予αPD1；shRNA序列 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节 |
| 色氨酸缺乏饮食实验 | 色氨酸缺乏饮食开始时间（αPD1注射前3天）及持续时间20天 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Fig. 6E-F图注 |