急性TEAD抑制对Hippo依赖性细胞的影响
验证GNE-7883急性处理是否抑制YAP/TEAD活性及细胞增殖。
用1 µM GNE-7883或DMSO处理H226和MSTO细胞48小时，检测细胞活力、EdU掺入、bulk RNA-seq和ATAC-seq。
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Hippo与MAPK通路激活的协同驱动对TEAD抑制的获得性耐药
Cooperation between the Hippo and MAPK pathway activation drives acquired resistance to TEAD inhibition.
实验完整度
高体外耐药细胞系、患者来源细胞系、小鼠移植瘤模型及多组学（RNA-seq、ATAC-seq、CUT&RUN、ChIP-seq）功能与机制验证
主要模型
NCI-H226（NF2缺失）间皮瘤细胞系 MSTO-211H（PSEN1-LATS1融合、LATS2失活）间皮瘤细胞系 H226-7883R和MSTO-7883R获得性耐药细胞系 C.B-17 SCID小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
GNE-7883处理浓度（1 µM用于短期处理，2.5 µM用于H226耐药维持，3 µM用于MSTO耐药维持） 耐药细胞系建立方式：GNE-7883浓度递增（0.25至2.5/3 µM）持续55天以上 体内给药剂量：GNE-7883 250 mg/kg皮下注射，Cobimetinib 7.5 mg/kg口服灌胃，每周3次 YAP/TEAD结合检测：免疫共沉淀和CUT&RUN FOSL1敲低（CRISPR sgRNA或siRNA）对耐药细胞活力及YAP/TEAD染色质结合的影响
摘要
TEAD（转录增强关联结构域）转录因子（TEAD1-4）是Hippo信号通路在多种癌症中的主要效应因子。靶向治疗会导致耐药性的出现，而癌症中对TEAD抑制的耐药机制尚不清楚。我们发现，AP-1（激活蛋白-1）转录因子的上调，以及YAP（yes相关蛋白）和TEAD活性的恢复，驱动了对泛TEAD抑制剂GNE-7883的耐药。急性GNE-7883处理会破坏YAP-TEAD结合并减弱FOSL1（FOS样1）活性。TEAD抑制剂耐药细胞恢复了YAP和TEAD的染色质占据，获得了额外的FOSL1结合，并表现出MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路活性增加。FOSL1是YAP和TEAD染色质结合所必需的。本研究描述了Hippo与MAPK通路之间具有临床相关性的相互作用，并强调了MAPK通路抑制剂在减轻Hippo通路依赖性癌症中对TEAD抑制的耐药性方面的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Hippo通路依赖性癌症中对TEAD抑制剂产生获得性耐药的分子机制是什么，以及如何克服这种耐药？
- 核心机制
- AP-1转录因子FOSL1上调并增强MAPK通路活性，FOSL1是YAP和TEAD染色质结合所必需的，三者协同恢复YAP/TEAD靶基因转录，驱动对GNE-7883的耐药。
- 主要证据
- 在H226和MSTO耐药细胞系中，GNE-7883急性处理抑制YAP/TEAD结合和靶基因表达，而耐药细胞恢复YAP/TEAD染色质占据和靶基因表达，并伴有FOSL1上调和MAPK通路活性升高；FOSL1敲低降低耐药细胞活力和YAP/TEAD染色质结合；MEK抑制剂Cobimetinib和pan-RAF抑制剂Belvarafenib降低FOSL1水平并恢复耐药细胞对GNE-7883的敏感性；小鼠移植瘤模型中联合用药抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了Hippo与MAPK通路在TEAD抑制剂耐药中的相互作用，提示MAPK通路抑制剂与TEAD抑制剂联用可能减轻或延缓Hippo通路依赖性癌症的耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立GNE-7883获得性耐药细胞模型
获得对TEAD抑制剂耐药的细胞系以研究耐药机制。
对H226和MSTO细胞进行GNE-7883浓度梯度递增长期处理，获得耐药池化细胞群，并通过活力试验验证耐药性。
耐药细胞的转录组和染色质可及性分析
比较亲本和耐药细胞在GNE-7883处理下的基因表达和染色质状态差异。
对亲本和耐药细胞进行bulk RNA-seq和ATAC-seq，分析Hippo、MAPK、凋亡和细胞周期相关基因集。
单细胞多组学解析耐药细胞转录调控网络
鉴定驱动耐药状态的转录因子。
对亲本和耐药细胞进行scMultiome（scRNA-seq+scATAC-seq）分析，使用Epiregulon推断转录因子活性。
验证YAP/TEAD/FOSL1的染色质结合
检测耐药细胞中YAP、TEAD1和FOSL1的染色质占据变化。
通过免疫荧光（预提取染色质结合蛋白）、CUT&RUN和ChIP-seq检测YAP、TEAD1和FOSL1在亲本和耐药细胞中的染色质结合。
FOSL1功能验证
确定FOSL1对耐药细胞存活及YAP/TEAD染色质结合的必要性。
用CRISPR或siRNA敲低FOSL1，检测耐药细胞活力及YAP/TEAD的CUT&RUN信号。
MAPK通路抑制对耐药细胞的体外增敏
测试MEK/RAF抑制剂能否降低FOSL1并克服耐药。
用Cobimetinib或Belvarafenib单独或联合GNE-7883处理亲本和耐药细胞，检测活力、FOSL1蛋白和染色质结合。
体内验证联合用药疗效
评估GNE-7883联合Cobimetinib对耐药移植瘤的生长抑制作用。
将H226-7883R和MSTO-7883R细胞皮下接种至C.B-17 SCID小鼠，待肿瘤建立后随机分组给予vehicle、GNE-7883、Cobimetinib或联合治疗。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因功能扰动
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich Corporation | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco Life Sciences | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega Corporation | -- |
| Vi-CELL细胞活力分析仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 药物处理 | GNE-7883 | -- | -- |
| GNE-6915 | -- | -- | |
| Cobimetinib | -- | -- | |
| Belvarafenib | -- | -- | |
| RNA提取 | Qiagen RNeasy Plus迷你试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RNA定量 | NanoDrop 8000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | QuantStudio 7 Flex实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| TaqMan探针 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | YAP抗体 | CST | 14074 |
| TEAD1抗体 | BD | 610923 | |
| FOSL1抗体 | ThermoFisher | PA5-66880 | |
| 驴抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 647二抗 | ThermoFisher | A-31573 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| EdU掺入 | Click-iT EdU试剂盒 | ThermoFisher | C10337 |
| 预提取 | Purecol胶原 | Advanced BioMatrix | 5005 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | 78439 | |
| 免疫沉淀 | Halt磷酸酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | 78427 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23228 | |
| pan-TEAD抗体 | CST | 13295S | |
| 正常兔IgG | CST | 2729S | |
| Protein A/G磁珠 | Pierce | 88802 | |
| Western blot | NuPAGE LDS上样缓冲液 | ThermoFisher | NP0007 |
| RIPA裂解缓冲液 | ThermoFisher | 89900 | |
| NuPAGE Bis-Tris 10%梯度凝胶 | Invitrogen | WG1203 | |
| NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液 | Invitrogen | NP0001 | |
| iBlot转膜系统 | Invitrogen | IB301001 | |
| YAP/TAZ抗体 | CST | 8418 | |
| pan-TEAD抗体 | CST | 13295 | |
| FOSL1抗体 | CST | 5281 | |
| CYR61抗体 | CST | 14479 | |
| CTGF抗体 | CST | 86641 | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| Actin抗体 | CST | 58169 | |
| 磷酸化ERK抗体 | CST | 9101S | |
| 总ERK抗体 | CST | 9102S | |
| 磷酸化MEK抗体 | CST | 9121S | |
| 总MEK抗体 | CST | 9122S | |
| CDK2抗体 | CST | 2546 | |
| CDK4抗体 | Proteintech | 11026-1-AP | |
| CDK6抗体 | CST | 13331 | |
| cyclin B1抗体 | CST | 4138 | |
| cyclin E2抗体 | Proteintech | 11935-1-AP | |
| 磷酸化RB抗体 | CST | 8180 | |
| 抗兔IgG轻链特异性二抗 | JacksonImmunoResearch | 211-032-171 | |
| 抗兔IgG二抗 | CST | 7074S | |
| 抗小鼠IgG二抗 | CST | 7076S | |
| Supersignal West Pico Plus化学发光底物 | ThermoFisher | 34580 | |
| CRISPR | Alt-R S.p. Cas9核酸酶V3 | IDT | 1081058 |
| siRNA | ON-TARGETplus人FOSL1 siRNA SMARTpool | Dharmacon Reagents | L-004341-00-0005 |
| ON-TARGETplus人YAP1 siRNA SMARTpool | Dharmacon Reagents | L-012200-00-0020 | |
| ON-TARGETplus非靶向对照pool | Dharmacon Reagents | D-001810-10-50 | |
| scMultiome | TotalSeq-A抗人Hashtag抗体 | Biolegend | -- |
| CUT&RUN | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | 14-1048 |
| CUTANA CUT&RUN文库构建试剂盒 | Epicypher | 14-1001 | |
| YAP抗体 | CST | 14074 | |
| TEAD1抗体 | BD | 610923 | |
| FOSL1抗体 | ThermoFisher | PA5-66880 | |
| ATAC-seq | Qiagen MinElute纯化试剂盒 | Qiagen | 28206 |
| NEBNext 2X PCR预混液 | -- | M0541L | |
| ChIP-seq | FOSL1抗体 | ThermoFisher | PA5-66880 |
| YAP抗体 | CST | 14074S | |
| Ovation Ultralow文库构建系统V2 | Tecan | -- | |
| 全外显子组测序 | Agilent Sureselect人全外显子V7捕获试剂盒 | Agilent | S31285117 |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| Methocel A15 LV | -- | -- | |
| Tween 80 | -- | -- | |
| 葵花籽油 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞系建立 | GNE-7883起始浓度0.25 µM，H226递增至2.5 µM，MSTO递增至3 µM，每两周以0.1-0.5 µM递增，保持至少25%汇合度，处理时长约55天 阅读提示：Methods 'Cell lines, cell viability assays'及Fig. 2A、Fig. S2A |
| 急性TEAD抑制实验 | GNE-7883浓度1 µM，处理时间48小时，对照DMSO 阅读提示：Results 'Hippo-dependent cell lines are arrested in G0/G1 phase upon acute treatment with GNE-7883'及Fig. 1C |
| 体内联合用药实验 | 细胞接种量1×10^7，小鼠品系C.B-17 SCID雌性7-10周龄，GNE-7883 250 mg/kg皮下注射，Cobimetinib 7.5 mg/kg口服灌胃，每周3次，每组7或9只 阅读提示：Methods 'Mouse xenograft'及Fig. 8A |
| FOSL1敲低实验 | sgRNA序列及浓度（sgFOSL1_1和sgFOSL1_2各22 µM），Cas9蛋白浓度36 µM，GNE-7883浓度1 µM，检测时间48小时（CUT&RUN）或96小时（活力） 阅读提示：Methods 'CRISPR and siRNA transfection' |
| CUT&RUN实验 | 细胞数5×10^5/反应，抗体用量（YAP 1:50，TEAD1或FOSL1 0.5 µg/反应），对照IgG 阅读提示：Methods 'CUT&RUN library preparation' |