ECM模型建立与ART治疗
建立实验性脑型疟疾模型并评估青蒿琥酯治疗效果。
C57BL/6 J雄性小鼠腹腔注射1×10^6 PbA感染红细胞建立ECM模型，于感染后d5–d8腹腔注射10 mg/kg ART，监测体重、寄生虫血症、生存和RMCBS，d8取材。
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小鼠脑在脑型疟疾进展及青蒿素治疗后的时空转录组分析
The spatiotemporal transcriptional profiling of murine brain during cerebral malaria progression and after artemisinin treatment.
实验完整度
高整合scRNA-seq与ST-seq两种独立组学，并结合IF、IHC、WB、ELISA及动物模型进行功能与机制验证
主要模型
PbA感染C57BL/6 J雄性小鼠ECM模型 ECM小鼠脑组织单细胞转录组 ECM小鼠脑矢状面空间转录组
重点核对
ECM模型通过腹腔注射1×10^6感染红细胞建立，每组n=12，监测至d8 ART组于感染后d5–d8腹腔注射10 mg/kg青蒿琥酯 scRNA-seq每组3个生物学重复，ST-seq每组2个生物学重复（各4张切片） IF/IHC每组n=3生物学独立样本，一抗稀释比1:100或1:200 WB检测p-Stat3/Stat3与Gzmk，每组n=3
摘要
脑型疟疾（CM）是一种由疟原虫感染引起的严重脑病，即使接受抗疟药物治疗，每年仍导致数千人死亡并遗留神经认知后遗症。尽管已有诸多机制研究，但空间背景下的细胞转录组重编程仍不清楚。本研究构建了实验性脑型疟疾（ECM）雄性小鼠脑组织在青蒿琥酯（ART）治疗前后的单细胞与空间转录组图谱。我们鉴定了ECM期间活化的炎性内皮细胞，其特征为血脑屏障破坏、抗原提呈增加及白细胞黏附。我们还观察到炎性小胶质细胞增强对CD8+细胞毒性T细胞的MHC-I等抗原提呈通路。后者发生炎症状态转变，细胞因子表达和细胞毒性活性上调。多组学分析显示，ECM期间受损神经元的干扰素-γ应答被激活，且在ART治疗后持续存在。总之，本研究为理解疟原虫-宿主相互作用机制及辅助疗法开发提供了宝贵资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ECM进展及青蒿琥酯治疗后，小鼠脑内各细胞类型的转录组重编程、空间分布及细胞间通讯如何变化，尤其是血脑屏障损伤、免疫细胞浸润和神经元损伤的机制。
- 核心机制
- ECM期间炎性内皮细胞活化伴随血脑屏障破坏、抗原提呈增加和白细胞黏附；炎性小胶质细胞通过MHC-I通路增强对CD8+细胞毒性T细胞的抗原提呈，后者发生炎症状态转变并上调细胞因子和细胞毒性活性；受损神经元干扰素-γ应答激活并在ART治疗后持续存在。
- 主要证据
- scRNA-seq和ST-seq图谱鉴定炎性内皮、炎性小胶质细胞和CD8+细胞毒性T细胞亚群及其空间共定位；IF、IHC、WB和ELISA验证相关标志物和通路；空间轨迹和细胞通讯分析揭示MHC-I等配体-受体互作。
- 研究意义
- 为理解疟原虫-宿主相互作用机制提供资源，并为辅助免疫调节疗法开发提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组与空间转录组图谱构建
全面解析ECM及ART治疗后脑组织的细胞组成和空间转录组特征。
对CON、ECM和ART组小鼠脑组织进行10x Genomics scRNA-seq和Visium ST-seq，整合公共健康脑ST-seq数据作为CON，进行细胞类型注释和空间定位。
炎性内皮细胞与血脑屏障损伤验证
验证ECM期间炎性内皮细胞活化及其与血脑屏障破坏、抗原提呈和白细胞黏附的关系。
从scRNA-seq提取BBB相关细胞并分亚型，计算模块评分和相关性；ST-seq空间定位炎性内皮模块评分及轨迹推断；IF和IHC验证CD31/CCL3、VCAM-1、ICAM-1等。
炎性小胶质细胞抗原提呈功能验证
探究ECM及ART治疗后小胶质细胞亚群的炎症状态和抗原提呈能力。
提取髓系细胞分亚型，DEG分析和GO富集，计算ST-seq免疫spot抗原加工提呈模块评分，IF验证IBA1/CCL3，空间展示Aif1和H2-K1表达。
CD8+细胞毒性T细胞状态转变验证
揭示ECM期间CD8+细胞毒性T细胞的招募、激活和状态转变。
提取淋巴细胞分亚型，伪时序分析CD8+细胞毒性T细胞轨迹，DEG和GO富集，WB验证p-Stat3/Stat3和Gzmk，IF验证CD8/KLRD1，ST-seq评估T细胞迁移和细胞毒性模块评分。
细胞间通讯与MHC-I通路分析
解析ECM及ART治疗后脑内细胞间通讯网络，尤其是MHC-I相关配体-受体互作。
CellChat和stLearn分析scRNA-seq与ST-seq的细胞通讯，比较ECM vs CON和ART vs CON的差异通路，IHC验证MHC-I，IF验证CD8a/IBA1/CD31共定位。
神经元干扰素应答的空间与单细胞验证
评估ECM及ART治疗后脑各区域神经元干扰素-γ应答的变化及持续情况。
ST-seq神经元spot按Allen脑图谱分10个区域，DEG和GO富集，计算IFN-γ应答模块评分；scRNA-seq神经元分亚型，GSEA验证IFN-γ应答。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | IBA1抗体 | Abcam | ab283319 |
| CCL3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-3656691 | |
| CD31抗体 | BD BioScience | 550274 | |
| CD8a抗体 | BD BioScience | 558733 | |
| KLRD1抗体 | Invitrogen | PA5-102259 | |
| CD68抗体 | Invitrogen | 14-0681-82 | |
| 免疫组化染色 | MHC I类抗体 | Invitrogen | MA5-44043 |
| VCAM1抗体 | ABclonal | A0279 | |
| ICAM1抗体 | ABclonal | A20472 | |
| 多重免疫组化 | Opal五色手动免疫组化试剂盒 | PerkinElmer | -- |
| CD3抗体 | Biolegen | 17A2 | |
| CD68抗体 | Biolegen | FA-11 | |
| NeuN抗体 | Invitrogen | 702022 | |
| 蛋白质印迹 | 磷酸化Stat3抗体 | Abcam | ab76315 |
| Stat3抗体 | ABclonal | A16975 | |
| Gzmk抗体 | Invitrogen | -- | |
| ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| Occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP | |
| 单细胞转录组 | 10x Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| 组织解离 | 成年脑组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 空间转录组 | Visium空间基因表达 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ECM模型建立与ART治疗 | 小鼠品系、性别、周龄和体重；PbA感染剂量与途径；ART剂量、给药途径和时间窗；每组样本量 阅读提示：Methods中“Mice in the CON, ECM Model and ART treatment groups”小节 |
| 单细胞与空间转录组 | 每组生物学重复数；scRNA-seq和ST-seq质控阈值；公共ST-seq数据集来源 阅读提示：Methods中“Single cell transcriptomics”和“Spatial transcriptomics”小节及Supplementary Fig. 2–3 |
| 免疫荧光与免疫组化验证 | 每组样本量；一抗稀释比；抗原修复和封闭条件 阅读提示：Methods中“Immunofluorescent staining (IF)”和“Immunohistochemical staining (IHC)”小节 |
| 蛋白质印迹与ELISA | 每组样本量；抗体稀释比；ELISA标准曲线和检测波长 阅读提示：Methods中“Western blot assay (WB)”和“Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”小节 |
| 空间轨迹与细胞通讯分析 | 轨迹分区定义和方向；配体-受体分析参数和显著性阈值 阅读提示：Methods中“Spatial trajectory inference analysis”和“Cell-cell communication analysis”小节及Fig. 3、Fig. 6 |