鉴定CCR4-NOT相互作用蛋白
寻找CCR4-NOT复合物的新调控因子
在2CLC诱导的mESC中表达GFP-CNOT9，通过亲和纯化结合质谱鉴定2CLC特异性结合蛋白，并利用co-IP验证候选蛋白与CNOT9的相互作用。
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MARTRE家族蛋白负调控CCR4-NOT活性以保护poly(A)尾长度并促进母源mRNA翻译
MARTRE family proteins negatively regulate CCR4-NOT activity to protect poly(A) tail length and promote translation of maternal mRNA.
实验完整度
高包含细胞系、体外生化、小鼠胚胎模型及多组学验证，并有功能与机制验证。
主要模型
TT2小鼠胚胎干细胞 HEK293细胞 HAP1细胞 Martre敲除小鼠胚胎
重点核对
Martre1/2过表达对poly(A)尾长度的影响（PAIso-seq） Martre1/2过表达对mRNA半衰期的影响（放线菌素D处理及mRNA-seq） MARTRE1对CCR4-NOT去腺苷酸化活性的体外抑制（重组蛋白滴定） Martre敲除小鼠胚胎的发育表型及单细胞转录组 Martre敲除1细胞期胚胎的翻译效率（Ribo-lite）
摘要
哺乳动物早期胚胎发育需要翻译从卵母细胞继承的母源mRNA。虽然poly(A)尾长度影响卵母细胞到胚胎转变（OET）过程中的mRNA翻译效率，但调节母源RNA poly(A)尾长度的分子机制尚不完全清楚。在本研究中，我们鉴定了一个先前未表征的蛋白家族MARTRE（MARTRE1-MARTRE6），其在小鼠OET期间表达并调节poly(A)尾长度。MARTRE通过与去腺苷酸化酶CCR4-NOT直接相互作用抑制去腺苷酸化，异位表达Martre通过减缓poly(A)尾缩短来稳定mRNA。Martre基因座缺失导致小鼠合子中poly(A)尾缩短和活跃翻译mRNA的翻译效率降低，但不影响母源mRNA降解。因此，MARTRE蛋白通过负调控CCR4-NOT的去腺苷酸化活性来精细调节母源mRNA翻译。此外，Martre敲除胚胎显示2细胞期进展延迟和植入前发育受损。总之，我们的研究结果强调了保护长poly(A)尾免受活跃去腺苷酸化是协调母源mRNA翻译的重要机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小鼠OET期间母源mRNA的poly(A)尾长度如何被调控以协调翻译？
- 核心机制
- MARTRE蛋白通过直接结合CCR4-NOT复合物（NOT模块）抑制其去腺苷酸化活性，保护长poly(A)尾免受缩短，从而维持母源mRNA的翻译效率。
- 主要证据
- 在细胞系中过表达Martre1/2导致poly(A)尾延长和mRNA半衰期增加；体外去腺苷酸化实验显示MARTRE1直接抑制CCR4-NOT活性；Martre敲除小鼠1细胞期胚胎中长尾转录本的poly(A)尾缩短、翻译效率降低，并出现2细胞期发育延迟。
- 研究意义
- 揭示了保护长poly(A)尾免受活跃去腺苷酸化是协调母源mRNA翻译的重要机制，为理解哺乳动物早期胚胎发育中母源基因表达调控提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MARTRE对poly(A)尾长度和mRNA稳定性的影响
探究MARTRE是否调控mRNA poly(A)尾长度及降解
在TT2 mESC中过表达MARTRE1/2，利用PAIso-seq测量转录组全局poly(A)尾长度，并用放线菌素D处理结合mRNA-seq测定mRNA半衰期。
体外验证MARTRE对CCR4-NOT去腺苷酸化活性的直接抑制
确定MARTRE是否直接抑制CCR4-NOT的去腺苷酸化酶活性
从HAP1细胞纯化内源CCR4-NOT复合物，使用FAM标记的A30 RNA底物进行体外去腺苷酸化实验，并滴定重组MARTRE1蛋白。
评估Martre敲除小鼠的胚胎发育表型
研究MARTRE在早期胚胎发育中的功能
构建Martre基因座敲除小鼠，通过时差成像观察植入前胚胎发育，并进行单细胞转录组分析2细胞期胚胎的基因表达动态。
检测Martre敲除对1细胞期胚胎poly(A)尾和翻译的影响
确定MARTRE在1细胞期胚胎中对母源mRNA尾长和翻译的调控作用
对WT和Martre mzKO 1细胞期胚胎进行PAIso-seq分析poly(A)尾长度，并利用Ribo-lite和核糖体缺失RNA-seq测量翻译效率和mRNA丰度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 白血病抑制因子 | Novoprotein | -- | |
| KnockOut血清替代物 | Life Technologies | -- | |
| 青霉素/链霉素 | BBI Life Sciences | -- | |
| 非必需氨基酸 | Sigma | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | BBI Life Sciences | -- | |
| 明胶 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Pan-biotech | -- | |
| T-REx 293细胞系 | Thermo | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Zeocin | InvivoGen | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | -- | |
| Lipo3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| VigoFect转染试剂 | Vigorous | -- | |
| siRNA转染 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 亲和纯化 | GFP-Trap M-270磁珠 | ChromoTek | -- |
| 抗HA琼脂糖树脂 | Smart-Lifesciences | -- | |
| 免疫共沉淀 | 抗Flag亲和凝胶 | Sigma | -- |
| RNase A/T1 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Abmart | M20008 |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗GFP抗体 | Abclonal | AE011 | |
| 抗β-Actin抗体 | Abclonal | AC026 | |
| 抗β-Tubulin抗体 | Cwbio | CW0098 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗Zscan4抗体 | Millipore | ab4340 | |
| 抗H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| 抗UHRF1抗体 | Santa Cruz | sc-373750 | |
| 抗G3BP1抗体 | Abclonal | A3968 | |
| 抗细胞色素C抗体 | Proteintech | 66264-1-Ig | |
| 抗CNOT1抗体 | Abclonal | A5969 | |
| 抗CNOT2抗体 | Santa Cruz | sc-81229 | |
| 抗CNOT4抗体 | Proteintech | 67798-1-Ig | |
| 抗CNOT8抗体 | Proteintech | 10752-1-AP | |
| 抗CNOT9抗体 | Proteintech | 22503-1-AP | |
| 抗CNOT10抗体 | Santa Cruz | sc-514570 | |
| 抗CNOT11抗体 | Santa Cruz | sc-377068 | |
| 兔二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| 鼠二抗 | Proteintech | SA00001-1 | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| 体外去腺苷酸化 | FAM标记RNA底物 | -- | -- |
| Typhoon FLA 7000激光扫描仪 | GE Healthcare | -- | |
| PAIso-seq | Klenow片段 | Thermo Fisher | EP0421 |
| USER酶 | NEB | M5505S | |
| RNA Clean & Concentrator-5试剂盒 | Zymo | R1015 | |
| Ribo-minus RNA-seq | Ribo-off rRNA去除试剂盒 | Vazyme | NR406 |
| VAHTS Universal V8 RNA-seq文库构建试剂盒 | Vazyme | NR605 | |
| Ribo-lite | RNase I | Ambion | AM2295 |
| SUPERase•In RNase抑制剂 | Ambion | AM2696 | |
| Dplex小RNA测序试剂盒 | Diagenode | C05030001 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman | A63882 | |
| mRNA-seq | DNA纯化试剂盒 | Genstone biotech | TD413 |
| 体外转录 | mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒 | Invitrogen | AM1345 |
| 胚胎电转 | NEPA21电转仪 | NEPA GENE | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与过表达 | 细胞系（TT2 mESC、T-REx 293、HAP1）、多西环素诱导浓度（1 μg/mL）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods中Cell culture及Cell line construction小节 |
| mRNA半衰期测定 | 放线菌素D浓度（2 μg/mL）、处理时间点（0、1、2、4、8 h）、内参（Drosophila S2 RNA） 阅读提示：Methods中mRNA half-life analysis小节 |
| 体外去腺苷酸化实验 | RNA底物浓度（100 nM）、CCR4-NOT复合物浓度（25 nM）、重组MARTRE1摩尔比、反应温度（30°C） 阅读提示：Methods中In vitro deadenylation assay小节 |
| 小鼠胚胎收集与培养 | 小鼠周龄（7-9周）、激素注射剂量（PMSG 5 IU，hCG 5 IU）、胚胎培养液（G1-Plus）、培养气体条件（5% O2, 5% CO2, 90% N2） 阅读提示：Methods中Oocyte and early embryo collection及Analysis of preimplantation embryo development小节 |
| Ribo-lite文库构建 | RNase I浓度（100 U/mL）、消化时间（45 min）、蔗糖垫超速离心条件（260,000 × g，4 h） 阅读提示：Methods中Ribo-lite library preparation and sequencing小节 |