鉴定SRX为CRLs底物
确定SRX是否受CRLs泛素-蛋白酶体途径调控。
用MLN4924处理SW480细胞进行无标记定量蛋白质组学，检测SRX上调；在四种CRC细胞系中验证MLN4924剂量和时间依赖性上调SRX；敲低NAE1、UBA3或UBC12验证遗传抑制neddylation对SRX的影响。
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CRL3Keap1 E3连接酶促进致癌蛋白SRX的泛素介导降解以抑制结直肠癌进展
CRL3Keap1 E3 ligase facilitates ubiquitin-mediated degradation of oncogenic SRX to suppress colorectal cancer progression.
实验完整度
高结合体外细胞实验、多种小鼠移植瘤模型及患者组织样本，且包含泛素化降解机制与功能验证。
主要模型
SW480和HCT116结直肠癌细胞系 HCT116皮下移植瘤裸鼠模型 HCT116尾静脉注射肺转移裸鼠模型 HCT116盲肠原位移植NCG小鼠模型
重点核对
Keap1敲低后SRX蛋白半衰期延长（CHX追踪实验） Keap1敲低或MLN4924处理抑制SRX泛素化（体内泛素化实验） SRX K61R突变体抵抗Keap1介导的降解（CHX追踪及泛素化实验） Keap1敲低细胞中AP-1/MMP9通路激活及迁移侵袭增强（Transwell及明胶酶谱） Keap1敲低细胞成瘤和转移能力依赖SRX（皮下、尾静脉及原位移植模型）
摘要
抗氧化蛋白sulfiredoxin-1（SRX）是促进肿瘤进展的致癌因子，但SRX降解的调控机制尚不清楚。在此，我们报道Keap1（CRL3复合物的底物特异性衔接蛋白）特异性结合并促进SRX在K61残基的泛素介导降解。Keap1敲低导致SRX积累，进而通过激活激活蛋白-1/基质金属蛋白酶9（AP-1/MMP9）通路促进结直肠癌（CRC）转移。CRC相关的Keap1 BACK结构域突变体丧失泛素化SRX的能力，反而促进CRC转移。此外，在肿瘤异种移植小鼠模型中，Keap1失活由于SRX积累而促进CRC肿瘤发生和转移。临床样本分析显示，CRC中Keap1下调而SRX过表达，这与不良预后相关。我们的发现阐明了一种机制：CRL3Keap1泛素连接酶降解SRX以抑制CRC进展，表明Keap1-SRX轴将指导CRC的靶向治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SRX作为致癌蛋白，其降解的上游调控机制及其在结直肠癌进展中的作用尚不清楚，本研究旨在阐明该机制。
- 核心机制
- CRL3Keap1 E3泛素连接酶通过其BACK结构域结合SRX，并在K61位点催化SRX泛素化降解；Keap1失活或CRC相关BACK结构域突变导致SRX积累，进而激活AP-1/MMP9通路促进CRC转移。
- 主要证据
- 体外泛素化、CHX追踪和GST pull-down实验证实Keap1直接结合并促进SRX K61位点泛素化降解；细胞迁移侵袭实验和AP-1/MMP9抑制剂实验证明该轴通过AP-1/MMP9通路促进转移；小鼠皮下、尾静脉和原位移植模型显示Keap1敲低促肿瘤生长和转移依赖SRX；临床样本分析显示Keap1与SRX表达负相关且SRX高表达与不良预后相关。
- 研究意义
- 揭示了Keap1-SRX轴抑制CRC进展的机制，提示靶向Keap1-SRX轴可能作为CRC治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SRX经泛素-蛋白酶体途径降解
明确SRX降解是否依赖蛋白酶体而非溶酶体。
用CHX阻断翻译，检测MLN4924对SRX半衰期的影响；用MG132或CQ处理，检测对SRX降解的抑制。
确定CRL3介导SRX泛素化降解
筛选负责SRX降解的Cullin蛋白。
敲低不同Cullin蛋白，检测SRX表达；敲低Cullin3或ROC1，检测SRX半衰期和泛素化水平。
鉴定Keap1为SRX的底物衔接蛋白
确定CRL3中特异性结合并降解SRX的衔接蛋白。
筛选BTB结构域衔接蛋白（Keap1、SPOP、KLHL22、LZTR1）；验证Keap1敲低对SRX表达和半衰期的影响；共免疫沉淀和GST pull-down验证Keap1与SRX直接结合；体内泛素化实验检测Keap1对SRX泛素化的影响。
确定SRX泛素化修饰位点
鉴定Keap1介导SRX泛素化的主要赖氨酸位点。
构建SRX K61R、K85R、K116R突变体，检测Keap1介导的降解和泛素化；CHX追踪检测SRX K61R突变体半衰期。
分析CRC相关Keap1突变对SRX结合和泛素化的影响
探究CRC相关Keap1 BACK结构域突变是否影响SRX结合和泛素化。
构建Keap1结构域缺失突变体，确定SRX结合结构域；从COSMIC数据库筛选CRC相关Keap1 BACK结构域突变体（A191D、L223M、C257Y、L291M），检测其与SRX结合和泛素化能力；检测CRC相关SRX突变体是否逃逸Keap1降解。
体内验证Keap1-SRX轴对CRC肿瘤发生和转移的影响
验证Keap1敲低诱导的肿瘤发生和转移是否依赖SRX。
用CRISPR/Cas9构建Keap1和/或SRX敲低的稳定HCT116和SW480细胞系；进行细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭实验；建立皮下移植瘤、尾静脉注射肺转移和盲肠原位移植模型，检测肿瘤生长、转移和生存期。
验证AP-1/MMP9通路在Keap1-SRX轴调控转移中的作用
探究Keap1-SRX轴是否通过AP-1/MMP9通路促进CRC转移。
检测Keap1和/或SRX敲低细胞中p-JNK、p-c-Jun、MMP9和EMT标志物表达；明胶酶谱检测MMP9活性；使用AP-1抑制剂T-5224或MMP9抑制剂MMP-9-IN-1处理Keap1敲低细胞，检测迁移和侵袭；回补Keap1-WT或突变体，检测对SRX积累和迁移侵袭的影响。
临床样本分析Keap1和SRX表达相关性及预后意义
评估Keap1和SRX在CRC临床样本中的表达相关性及预后价值。
对128例正常组织和136例CRC组织进行IHC染色，分析SRX表达与临床病理特征和生存期的关系；对10对CRC及癌旁组织进行western blotting，分析Keap1和SRX表达相关性；利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析Keap1 mRNA与生存期的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白降解和泛素化
验证分子表达和活性变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Basal Media Technology | -- |
| 胎牛血清 | Aus GeneX | -- | |
| McCoy's 5A培养基 | Basal Media Technology | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Basal Media Technology | -- | |
| MEM培养基 | Basal Media Technology | -- | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 突变体构建 | Phusion定点突变试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗体 | SRX抗体 | Santa Cruz | sc-514940 |
| SRX抗体 | Santa Cruz | sc-166566 | |
| SRX抗体 | Santa Cruz | sc-166786 | |
| Keap1抗体 | Cell Signaling Technology | 8047 | |
| Keap1抗体 | Cell Signaling Technology | 4678 | |
| NAE1抗体 | Cell Signaling Technology | 14321 | |
| p27抗体 | Cell Signaling Technology | 3686 | |
| Cullin3抗体 | Cell Signaling Technology | 2759 | |
| Cullin4A抗体 | Cell Signaling Technology | 2699 | |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9255 | |
| 磷酸化c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 3270 | |
| MMP9抗体 | Cell Signaling Technology | 13667 | |
| MMP9抗体 | ABclonal | A25299 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | ABclonal | A22333 | |
| Snail抗体 | Cell Signaling Technology | 3879 | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | E4I2J | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | P37 | |
| UBA3抗体 | Abcam | ab124728 | |
| UBE2M/UBC12抗体 | Abcam | ab109507 | |
| ROC1抗体 | Abcam | ab133565 | |
| Cullin1抗体 | Abcam | ab75817 | |
| Cullin2抗体 | Abcam | ab166917 | |
| Cullin4B抗体 | Abcam | ab67035 | |
| Cullin5抗体 | Abcam | ab184177 | |
| NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| Flag标签抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| β-肌动蛋白抗体 | HuaBio | EM21002 | |
| 免疫沉淀 | Anti-Flag M2亲和凝胶 | Merck | A2220 |
| Anti-HA标签小鼠抗体（琼脂糖偶联） | Abmart | M20013M | |
| 药物处理 | MLN4924 | MCE | HY-70062 |
| MG132 | Sigma Aldrich | 474790 | |
| MMP-9-IN-1 | MCE | HY-135232 | |
| T-5224 | MCE | HY-12270 | |
| 药物溶解 | 二甲基亚砜 | MCE | HY-Y0320 |
| 细胞活力检测 | ATP-Lite发光检测试剂盒 | PerkinElmer | -- |
| 细胞侵袭实验 | Matrigel聚碳酸酯膜 | Corning | -- |
| 免疫组化 | DakoCytomation EnVision+ System-HRP检测试剂盒 | Dakocytomation | -- |
| SRX抗体 | Shanghai Biochip | -- | |
| 原位移植瘤成像 | IVIS Lumina III成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SRX降解和泛素化分析 | CHX浓度50 μg/mL；MLN4924浓度1 μM；MG132浓度20 μM；CQ浓度40 μM；处理时间点（文中部分未明确说明） 阅读提示：Methods中Cycloheximide chase assay、In vivo ubiquitination assay及Fig. 1图注 |
| Keap1-SRX结合验证 | 重组蛋白用量：GST-Keap1 30 μg，His-SRX 20 μg；GST-Keap1-BACK 30 μg；孵育条件4°C 阅读提示：Methods中Protein purification and GST pull-down assay及Fig. 2e、Fig. 3d图注 |
| 细胞迁移和侵袭实验 | 细胞接种密度：HCT116 1.5×10^5/孔，SW480 2×10^5/孔；T-5224浓度10 μM处理48 h；MMP-9-IN-1浓度40 μM处理48 h 阅读提示：Methods中Cell migration and invasion assays及Fig. 5图注 |
| 动物模型实验 | 小鼠品系和周龄：Balb/c nude（5周龄或6周龄）、NCG（7周龄）；细胞接种数量：皮下3×10^6、尾静脉2.5×10^6、原位2×10^6；每组小鼠数量：皮下8只、尾静脉5只、原位5只 阅读提示：Methods中Animal model of tumor xenograft及Fig. 4图注 |
| 临床样本分析 | 样本量：正常组织128例、CRC组织136例、配对组织10对；IHC评分方法H-score；抗体来源Shanghai Biochip 阅读提示：Methods中Tumor tissue collection、Immunohistochemistry analysis及Fig. 6图注 |