全基因组CRISPR筛选鉴定palbociclib和giredestrant敏感性调节基因
鉴定调节CDK4/6抑制剂和内分泌治疗敏感性的基因
在MCF-7 iCas9细胞中进行全基因组CRISPR/Cas9筛选，转导sgRNA文库后诱导Cas9，分别用palbociclib或giredestrant处理，深度测序比较sgRNA丰度
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抑制GPX4增强乳腺癌中CDK4/6抑制剂和内分泌治疗的活性
Inhibition of GPX4 enhances CDK4/6 inhibitor and endocrine therapy activity in breast cancer.
实验完整度
高包含全基因组CRISPR筛选、多种细胞系功能验证、脂质组学、转录组/蛋白质组分析及MCF-7异种移植瘤体内验证。
主要模型
MCF-7 ER+乳腺癌细胞系 T47D ER+乳腺癌细胞系 TNBC细胞系（Cal51、Cal120、Sum149、Sum159等） MCF-7及MCF-7 GPX4 null皮下异种移植瘤（NSG小鼠）
重点核对
GPX4敲除克隆的验证：MCF-7和T47D GPX4 null克隆的Western blot确认 palbociclib处理浓度与时间：500 nM处理2周（克隆形成）或6天（存活曲线） giredestrant预处理方案：1 nM预处理7天，联合RSL3矩阵剂量处理7天 异种移植瘤模型：MCF-7或MCF-7 GPX4 null细胞皮下接种，palbociclib 25 mg/kg每日口服 脂质过氧化检测：C11-BODIPY 581/591和MitoPerOx染色，流式检测至少10,000细胞
摘要
CDK4/6抑制联合内分泌治疗是雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌的标准治疗，尽管常观察到细胞生长停滞，但仍需要增强疗效的新策略。本研究开展了两项独立的全基因组CRISPR筛选，以鉴定CDK4/6和内分泌治疗敏感性的遗传决定因素。参与氧化应激和铁死亡的基因调节敏感性，其中GPX4在两项筛选中均为最显著的增敏基因。在ER+乳腺癌模型中，GPX4的缺失或抑制增加了对palbociclib和giredestrant及其联合治疗的敏感性，GPX4缺失的异种移植瘤对palbociclib高度敏感。GPX4扰动还使三阴性乳腺癌（TNBC）模型对palbociclib敏感。Palbociclib和giredestrant诱导氧化应激和脂质代谢紊乱，导致铁死亡敏感状态。在ER+乳腺癌模型中，脂质过氧化由过氧化物酶体AGPAT3依赖途径促进，而非经典的ACSL4途径。我们的数据表明，CDK4/6和ER抑制创造了铁死亡诱导的脆弱性，可通过与GPX4抑制剂联合加以利用，以增强乳腺癌对当前治疗的敏感性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CDK4/6抑制剂和内分泌治疗在乳腺癌中诱导的敏感性决定因素是什么，以及能否通过靶向这些因素增强疗效？
- 核心机制
- CDK4/6和ER抑制导致细胞周期阻滞，引起氧化还原-脂质失衡，增加PUFA生成、降低GPX4和铁蛋白水平并增加脂质过氧化，从而创造铁死亡脆弱状态；在ER+模型中脂质过氧化由过氧化物酶体AGPAT3/FAR1途径而非ACSL4途径促进。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定GPX4为增敏靶点；GPX4缺失或抑制增加ER+和TNBC细胞系对palbociclib、giredestrant及其联合的敏感性；脂质组学显示PUFA-磷脂增加；MCF-7 GPX4 null异种移植瘤对palbociclib更敏感。
- 研究意义
- CDK4/6和ER抑制创造铁死亡诱导脆弱性，联合GPX4抑制剂可增强当前乳腺癌治疗敏感性，并可能扩展CDK4/6抑制剂可靶向的乳腺癌类型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GPX4缺失或抑制对CDK4/6抑制剂敏感性的验证
验证GPX4缺失是否增加ER+乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂的敏感性
使用CRISPR Edit-R系统构建GPX4敲除克隆，或用RSL3/ML210抑制GPX4，进行克隆形成实验和细胞存活实验检测对palbociclib、abemaciclib、ribociclib的敏感性
GPX4抑制剂与CDK4/6抑制剂联合效应的评估
评估GPX4抑制剂联合CDK4/6抑制剂在ER+和TNBC细胞系中的协同效应
在ER+和TNBC细胞系中进行剂量矩阵联合处理，用Bliss模型计算协同分数，并进行克隆形成实验
CDK4/6和ER抑制诱导脂质过氧化和铁死亡脆弱状态的机制研究
探究palbociclib和giredestrant是否诱导脂质过氧化及铁死亡敏感状态
用C11-BODIPY和MitoPerOx检测脂质过氧化，用铁死亡抑制剂进行 rescue 实验，检测GPX4和铁蛋白水平，进行脂质组学和转录组/蛋白质组分析
脂质过氧化途径的分子机制解析
确定ER+乳腺癌中脂质过氧化依赖的酶途径
通过siRNA或CRISPR敲低AGPAT3、FAR1、ACSL4，检测对RSL3诱导的脂质过氧化和细胞死亡的影响
GPX4缺失异种移植瘤对palbociclib敏感性的体内验证
验证GPX4缺失是否在体内增加MCF-7异种移植瘤对palbociclib的敏感性
将MCF-7或MCF-7 GPX4 null细胞皮下接种到NSG小鼠，肿瘤达到150-200 mm3后随机分组，给予vehicle或palbociclib治疗，监测肿瘤体积
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | Edit-R诱导型慢病毒hEF1a-Blast-Cas9核酸酶 | Dharmacon | -- |
| 人慢病毒CRISPR文库 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 帕博西尼（PD0332991）乙磺酸盐 | Selleckchem | S1579 |
| RSL3 | Selleckchem | S8155 | |
| ML210 | Selleckchem | S0788 | |
| Liproxstatin-1 | Selleckchem | S7699 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML-0583 | |
| L-二氢乳清酸 | Sigma-Aldrich | D7128 | |
| TEMPO | Sigma-Aldrich | 2564-83-2 | |
| 流式分析 | C11-BODIPY581/591染料 | ThermoFisher Scientific | D3861 |
| MitoPerOx染料 | Abcam | ab146820 | |
| Western blot | 抗GPX4抗体 | Cell Signaling Technology | 52455 |
| 抗SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| 抗磷酸化SirT1（Ser47）抗体 | Cell Signaling Technology | 2314 | |
| 抗磷酸化CDK2（Thr160）抗体 | Cell Signaling Technology | 2561 | |
| 抗磷酸化RB1 S807/811抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| 抗cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| 抗cleaved Casp3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗5-脂氧合酶（ALOX5）抗体 | Cell Signaling Technology | 3289 | |
| 抗FAR1抗体 | Novus Biologicals, LLC | NBP1-89847 | |
| 抗AGPAT3抗体 | abcam | ab211435 | |
| 单克隆抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 | |
| 抗ACSL4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365230 | |
| 抗铁蛋白抗体 | abcam | ab75973 | |
| 抗ATXN7L3抗体 | abcam | ab99947 | |
| HRP标记抗兔IgG | Sigma | A99169 | |
| HRP标记抗鼠IgG | Sigma | A9044 | |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354230 |
| 动物实验 | 雌激素缓释片 | Innovative Research of American | NE-121 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 |
| 流式分析 | Hoechst 33342 | ThermoFisher | -- |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 克隆形成实验 | 磺基罗丹明B溶液 | -- | -- |
| 脂质组学 | Lipidyzer平台 | -- | -- |
| AB Sciex 6500+液相色谱-串联质谱仪 | AB Sciex | -- | |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Lumos质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| TMTpro试剂 | Thermo | -- | |
| siRNA转染 | 针对AGPAT3的siGENOME人SMARTpool | Dharmacon | M-008620-00 |
| 针对FAR1的siGENOME人SMARTpool | Dharmacon | M-014806-01 | |
| 针对ACSL4的siGENOME人SMARTpool | Dharmacon | M-009364-00 | |
| 针对ATXN7L3的siGENOME人SMARTpool | Dharmacon | M-023237-01 | |
| CRISPR敲除 | 预设计sgGPX4 | Dharmacon | CM-011676 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组CRISPR筛选 | 细胞模型（MCF-7 iCas9）、sgRNA文库覆盖度、MOI（0.3）、palbociclib浓度（500 nM）和处理时间（2周）、giredestrant浓度（0.6 nM） 阅读提示：Methods中'Genome-wide CRISPR/Cas9 screen'小节及Supplementary Methods |
| GPX4敲除与CDK4/6抑制剂敏感性验证 | GPX4敲除克隆的验证方法、palbociclib处理浓度（500 nM）和时间（12天克隆形成/6天存活）、RSL3/ML210使用浓度 阅读提示：Methods中'Clonogenics'和'Cellular viability assays'小节，以及Figure 1和2图注 |
| 联合用药协同效应评估 | 药物浓度矩阵设计、Bliss协同模型参数、细胞系类型（ER+和TNBC）、处理时间（7天） 阅读提示：Methods中'Cellular viability assays'小节和Figure 2图注 |
| 脂质过氧化检测 | C11-BODIPY和MitoPerOx染料浓度（5 μM）、流式细胞术门控策略、处理时间（6天） 阅读提示：Methods中'Flow cytometry analysis for lipid peroxidation'小节和Figure 3图注 |
| 异种移植瘤实验 | 小鼠品系（NSG）、细胞接种数量（1×10^7）、Matrigel比例（1:1）、palbociclib剂量（25 mg/kg）和给药途径（口服每日）、肿瘤体积测量方法、每组肿瘤数（5-7） 阅读提示：Methods中'Tumour xenografts'小节和Figure 7图注 |
| 脂质组学分析 | 细胞处理条件（giredestrant 1 nM, palbociclib 200 nM）、处理时间（7天）、脂质提取方法、内标使用 阅读提示：Methods中'Lipidomics sample preparation'和'Extraction and analysis'小节 |