多模态RBP相互作用数据生成
获取RBP的物理与功能相互作用读出
在K562细胞中构建50个BioID2-RBP融合株并进行生物素邻近标记-链霉亲和素富集-质谱；对68个RBP进行Perturb-seq；重分析ENCODE eCLIP数据
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
转录后调控模块的系统性鉴定
Systematic identification of post-transcriptional regulatory modules.
实验完整度
高含BioID2邻近标记、Perturb-seq、eCLIP、RNA-seq、Ribo-seq、ATAC-seq、ChIP-qPCR、CLIP-seq等多层级功能与机制验证
主要模型
K562细胞系 293T细胞系 BioID2-RBP融合稳定表达K562细胞
重点核对
BioID2实验：12×10^6细胞/重复，50 μM生物素处理24 h，对照用DMSO，生物素去除培养基预培养72 h Perturb-seq：205条sgRNA文库（5条非靶向+200条靶向100个基因，每基因2条），68个RBP CRISPRi敲低效率：ZC3H11A与TAF15分别96%和98%（对照非靶向guide） α-amanitin处理：10 μg/mL处理8–9 h，2个重复，用于mRNA稳定性测定 Ribo-seq与匹配RNA-seq：对照与TAF15敲低细胞，检测翻译变化
摘要
在细胞中，数量有限的RNA结合蛋白（RBP）负责整个转录组中RNA代谢的各个方面。为实现这一功能，RBP形成作用于特定靶调控子（regulon）的调控单元。然而，RBP组合性相互作用的图景仍缺乏探索。本文通过多模态数据整合对RBP组合性相互作用进行系统性注释。我们通过对50种人类RBP生成体内邻近依赖性生物素化数据集，构建了大规模RBP蛋白邻域图谱。同时，我们利用带单细胞读出的CRISPR干扰捕获RBP敲低后的转录组变化。通过整合这些物理与功能相互作用读出，以及来自eCLIP实验的RBP mRNA靶标图谱，我们构建了功能性RBP相互作用的整合图谱。随后我们利用该图谱将RBP匹配到其情境特异性功能，并对四种RBP的预测功能进行了生化验证。本研究提供了RBP相互作用的详细图谱，并将其解卷积为具有注释功能和靶调控子的不同调控模块。这一多模态整合框架为研究转录后调控过程提供了有原则的方法，并丰富了对其潜在机制的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何系统注释RBP之间的组合性相互作用，并将RBP-RNA结合事件解卷积为具有特定功能与靶调控子的调控模块？
- 核心机制
- RBP通过物理共定位、共享RNA靶标及参与同一调控通路形成组合性调控模块；单个RBP可依情境对独立调控子分别调控可变剪接、翻译或稳定性，部分RBP（如QKI、ZNF800）还通过结合染色质相关RNA直接参与转录抑制。
- 主要证据
- 对50个RBP的BioID2邻近标记、68个RBP的Perturb-seq、ENCODE eCLIP整合构建IRIM；并通过CRISPRi敲低结合RNA-seq、RT-qPCR、CLIP-seq、Ribo-seq、定量质谱、α-amanitin稳定性实验、ATAC-seq与ChIP-qPCR对ZC3H11A、TAF15、QKI、ZNF800进行验证。
- 研究意义
- 提供了RBP相互作用的详细图谱并将RBP-RNA结合事件解卷积为具有注释功能与靶调控子的调控模块，为研究转录后调控过程提供了多模态整合的原则性框架并丰富了对相关机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建整合调控相互作用图谱（IRIM）
整合三类数据量化RBP-RBP相似性并鉴定调控模块
对各模态标准化后计算RBP两两余弦距离与经验p值，用logitp合并为统一概率评分，层次聚类得到IRIM
RBP功能注释与配体转移
为RBP及模块赋予通路功能注释
基于BioID邻域富集排序进行GSEA注释GO-BP通路；并用最近邻标签转移推断RBP潜在功能
ZC3H11A与TAF15功能验证
验证二者在剪接、翻译和RNA稳定性中的多效性作用
CRISPRi敲低后进行RNA-seq分析可变剪接，RT-qPCR验证ASE，CLIP-seq确认直接结合；对TAF15进行Ribo-seq、定量质谱和α-amanitin稳定性实验
QKI与ZNF800转录调控验证
验证二者在转录调控与染色质可及性中的作用
CRISPRi敲低后进行ATAC-seq和RNA-seq，ChIP-qPCR检测启动子结合，并与公开ChIP-exo数据比较
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证染色质与转录调控
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B | Life Technologies Corporation | 15290026 | |
| BioID2-RBP融合株构建 | Gateway LR Clonase II酶混合液 | Thermo Fisher | 11791020 |
| 慢病毒转染 | NanoFect转染试剂 | ALSTEM | NF100 |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | Millipore | C788D57 |
| 细胞筛选 | 杀稻瘟菌素 | Gibco | A1113903 |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A1113802 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | SIAL-R0278-50ML |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | PI78410 | |
| LDS上样缓冲液 | Invitrogen/Fisher Scientific | NP0007 | |
| 二硫苏糖醇 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | NAT1068 | |
| Bis-Tris NuPAGE凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | WP2HY315F5 | |
| 牛血清白蛋白 | VWR International | 97064-340 | |
| 抗HA抗体 | BioLegend | 901533 | |
| 抗eIF3I抗体 | BioLegend | 646701 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| BioID2富集 | Halt磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78420 |
| 核酸酶 | EMD Millipore | 706643 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | A55865 | |
| MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65001 | |
| 质谱样品制备 | Vivacon 500 Hydrosart离心过滤器 | Sartorius | -- |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U1250-5KG | |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | A64141-500G | |
| 质谱级胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T6567-1MG | |
| Perturb-seq | Q5热启动高保真2X预混液 | NEB VWR International | 102500-140 |
| BsmBI限制酶 | Fisher Scientific | FERER0451 | |
| ZymoPURE II质粒中提试剂盒 | Zymo Research | D4200 | |
| 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | P1304MP | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23317 | |
| CRISPRi敲低 | TransIT-Lenti转染试剂 | Mirus | 75814-982 |
| RT-qPCR | PerfeCTa SYBR Green预混液 | QuantaBio | 95054-500 |
| RNA提取 | Zymo QuickRNA提取试剂盒 | Zymo Research | R1054 |
| RNA稳定性实验 | α-鹅膏蕈碱 | Sigma-Aldrich | A2263 |
| RNA提取 | Zymo QuickRNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
| RNA-seq | SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒v2-哺乳动物Pico输入 | Takara | 634411 |
| 核糖体印迹 | Turbo DNA酶 | Thermo Fisher Scientific | AM2238 |
| Qubit RNA高灵敏度试剂盒 | Thermo Fisher | Q32852 | |
| RNase I | Epicenter VWR International | 101228-268 | |
| SUPERaseIN RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | |
| Zymo RNA纯化浓缩试剂盒-25 | Zymo Research | R1017 | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S | |
| T4 RNA连接酶2截短型K227Q | NEB | M0351S | |
| RecJ核酸酶 | NEB | M0264S | |
| ProtoScript II逆转录酶 | NEB | M0368S | |
| ATAC-seq | DNA纯化浓缩试剂盒-5 | Zymo Research | D4014 |
| NEBNext文库定量试剂盒 | New England Biolabs | E7630 | |
| ChIP-qPCR | Protein A/G磁珠 | Fisher Scientific | 88802 |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| CLIP-seq | RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | |
| 抗TAF15抗体 | Thermo | MA3-078 | |
| 抗ZC3H11A抗体 | Abcam | ab241612 | |
| IRDye 800CW DBCO红外染料 | LI-COR | 929-50000 | |
| SeqAmp DNA聚合酶 | Takara | 638509 | |
| 免疫荧光 | 多聚-D-赖氨酸 | MP Biomedical | 0215017550 |
| 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Life Technologies | P36941 | |
| Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 780 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BioID2邻近标记 | 细胞数（12×10^6/重复）、生物素浓度（50 μM）、处理时间（24 h）、对照（DMSO）、生物素去除预培养（72 h） 阅读提示：Methods中Biotin treatment and pulldown |
| Perturb-seq | sgRNA文库组成（205条，含5条非靶向）、靶向基因数与RBP数（68个RBP）、感染复数与筛选浓度（2 μg/mL嘌呤霉素3天） 阅读提示：Methods中Perturb-seq |
| CRISPRi敲低 | 各基因敲低效率、dCas9-KRAB细胞株来源、sgRNA载体 阅读提示：Methods中CRISPRi-mediated gene knockdown及Supplementary Fig. S7、S9 |
| 剪接与翻译验证 | RT-qPCR生物学重复数（n=3）、Ribo-seq与匹配RNA-seq设计、统计方法与阈值（Bayes factor≥10、FDR<0.05） 阅读提示：Fig. 4、Fig. 5图注及Methods中Alternative splicing analysis、Ribosome profiling analysis |
| mRNA稳定性与染色质验证 | α-amanitin浓度（10 μg/mL）与处理时间（8–9 h）、ATAC-seq每样本细胞数（50000）、ChIP-qPCR抗体用量（3 μg）与细胞数（2×10^7） 阅读提示：Methods中RNA treatment with α-amanitin、ATAC-seq、ChIP-qPCR |