优化FGFR4 CAR的HTM和CSD并评估体外功能
比较不同HTM和CSD对FGFR4 CAR T细胞杀伤和细胞因子产生的影响。
构建FGFR4.8HTM.BBz、FGFR4.28HTM.BBz和FGFR4.28HTM.28z CAR，转导人T细胞，与RMS细胞系共培养，用xCELLigence RTCA检测细胞毒性，用V-PLEX检测IFN-γ等细胞因子。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
同时靶向FGFR4和CD276的CAR T细胞对儿童横纹肌肉瘤显示出强效抗肿瘤作用
CAR T-cells targeting FGFR4 and CD276 simultaneously show potent antitumor effect against childhood rhabdomyosarcoma.
实验完整度
高含体外细胞系杀伤、多种体内异种移植模型、CRISPR敲除验证、CITE-Seq及信号通路机制验证
主要模型
RH30（FP-RMS）细胞系及原位异种移植模型 RMS559（FN-RMS，FGFR4 V550L突变）细胞系及原位异种移植模型 JR（FP-RMS）细胞系及原位异种移植模型 RMS患者来源异种移植瘤（PDX）
重点核对
体内CAR T细胞输注剂量：1E+6、2.5E+6或10E+6 CAR阳性T细胞，尾静脉注射 体外细胞毒性实验效靶比：1:8、1:10或1:1 抗原刺激浓度：FGFR4-Fc/CD276-Fc系列稀释，0.00625 μM至0.025 μM以上 Western blot刺激时间点：5、15、30分钟 流式细胞术检测 exhaustion 标志物（CD39、PD-1、LAG-3、TIM-3）
摘要
靶向成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）的嵌合抗原受体（CAR）T细胞已进入临床开发阶段，但肿瘤异质性和次优激活可能削弱其效力。本文报告了一种优化FGFR4 CAR共刺激和靶向特性的策略：将CD8铰链和跨膜结构域及4-1BB共刺激结构域替换为CD28的相应结构域。所得CAR在多个RMS异种移植模型中显示出增强的抗肿瘤活性，但侵袭性肿瘤细胞系RMS559除外。通过寻找RMS核心调控转录因子MYOD1的直接靶点，我们鉴定出另一个表面蛋白CD276作为潜在靶点。同时靶向FGFR4和CD276的双顺反子CAR（BiCisCAR），包含两个不同的共刺激结构域，与优化的FGFR4特异性CAR及具有相同4-1BB共刺激结构域的其他BiCisCAR相比，具有更优的持久性和增强的抗肿瘤活性。因此，本研究为靶向FGFR4和CD276的CAR T细胞治疗RMS奠定了概念验证基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何优化FGFR4 CAR的共刺激和靶向特性，并构建同时靶向FGFR4和CD276的双靶点CAR以克服RMS抗原异质性并增强抗肿瘤效果。
- 核心机制
- BiCisCAR同时含有CD28和4-1BB共刺激结构域，双抗原 engagement 时通过互补激活AKT、ERK1/2和NF-κB信号通路，产生协同细胞因子分泌和细胞毒性，并维持持久性、减少耗竭。
- 主要证据
- 在RH30、RMS559和JR原位异种移植模型中，FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.BBz BiCisCAR展现出最快的肿瘤清除、最高的T细胞扩增和最少耗竭；CRISPR-KO实验证明其可克服单抗原丢失；CITE-Seq显示细胞毒性基因高表达；Western blot显示双刺激下信号通路持续磷酸化。
- 研究意义
- 为靶向FGFR4和CD276的CAR T细胞治疗RMS提供了概念验证，并提示具有两种不同共刺激结构域的双靶点BiCisCAR设计可同时应对抗原异质性和提高T细胞效能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在RH30和RMS559原位异种移植模型中评估优化CAR的体内抗肿瘤活性
验证CD28 HTM/CSD替换是否在应激条件下增强体内抗肿瘤效果和生存获益。
将 luciferase 标记的RH30或RMS559细胞肌内注射至NSG小鼠，肿瘤植入后7或14天尾静脉输注CAR T细胞，监测腿体积和生物发光，检测血液CAR T细胞扩增和耗竭标志物。
鉴定CD276作为RMS表面靶点并量化FGFR4和CD276表达
确认CD276在RMS中的表达及其作为第二靶点的合理性，并量化两种抗原在细胞系和PDX上的密度。
重新分析ChIP-seq数据确认PAX3-FOXO1和MYOD1结合CD276增强子；用流式细胞术和PE定量试剂盒检测RMS细胞系、CDX和PDX表面FGFR4和CD276分子数；分析RNA-Seq数据。
构建并筛选靶向FGFR4和CD276的双顺反子CAR
比较不同BiCisCAR设计的体外杀伤和体内抗肿瘤活性，选出最优组合。
构建三种BiCisCAR（FGFR4.8HTM.BBz-CD276.8HTM.BBz、FGFR4.28HTM.BBz-CD276.8HTM.BBz、FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.BBz），转导T细胞，在RH30和RMS559模型中进行体外细胞毒性和体内治疗实验。
在 aggressive JR 模型和高应激条件下评估最优BiCisCAR
验证FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.BBz BiCisCAR在低抗原密度和低细胞剂量下的效力。
使用JR细胞（CD276较低表达）建立原位模型，输注2.5E+6 CAR T细胞；在RMS559模型中仅输注1E+6 CAR T细胞；检测血液和肿瘤中CAR T细胞扩增、浸润和耗竭标志物。
通过CITE-Seq分析肿瘤浸润CAR T细胞的转录组和表面蛋白
揭示最优BiCisCAR T细胞在体内的分子表型和细胞亚群分布。
从JR荷瘤小鼠输注CAR T细胞后11天分离肿瘤浸润T细胞，用TotalSeq-C hashtag和17种表面蛋白panel进行CITE-Seq，用Seurat进行WNN分析和差异表达分析。
利用CRISPR-KO验证BiCisCAR克服抗原异质性
证明双靶向CAR可清除丢失单一靶抗原的肿瘤细胞。
在RH30细胞中CRISPR敲除FGFR4或CD276，进行体外细胞毒性实验；建立双侧原位模型（一侧FGFR4-KO，另一侧CD276-KO），输注单靶点或双靶点CAR T细胞，监测肿瘤生长。
检测双抗原刺激下的细胞因子分泌和TCR信号通路磷酸化
阐明两种不同共刺激结构域产生协同效应的信号机制。
用板包被的FGFR4-Fc、CD276-Fc或两者刺激BiCisCAR T细胞，检测IFN-γ、IL-2、TNF-α；用Western blot检测CD3ζ、ZAP70、PLCγ1、AKT、ERK1/2和p65磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Quality Biological | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Life technologies | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco, Life technologies | -- | |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| CRISPR基因编辑 | lentiCRISPRv2 puro载体 | Addgene | 98290 |
| PBMC分离 | Histopaque®-1.077密度梯度分离液 | Sigma | 10771 |
| T细胞激活 | Dynabeads人T细胞扩增CD3/CD28微珠 | Thermo Fisher Scientific | 11141D |
| T细胞培养 | AIM-V培养基 | Invitrogen | -- |
| 重组IL-2 | Clinigen Inc. | -- | |
| 抗原定量流式 | 抗人FGFR4抗体（克隆3A11） | in-housed | -- |
| 重组人源化抗人CD276抗体（克隆MGA271） | Creative Biolabs | TAB-117CL | |
| 流式二抗 | PE标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Biolegend | 405307 |
| R-藻红蛋白AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-170 | |
| 抗原定量 | Quantibrite PE定量试剂盒 | BD Biosciences | 340495 |
| 细胞毒性实验 | E-Plate 16细胞培养板 | ACEABiosciences | -- |
| 细胞因子检测 | V-PLEX定制人生物标志物促炎panel 1 | Meso Scale Discovery | -- |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| 生物发光成像 | D-荧光素 | PerkinElmer | -- |
| RBC裂解 | 红细胞裂解液 | BioLegend | 420301 |
| 流式抗体 | CD45-FITC抗体（克隆HI30） | BioLegend | 304006 |
| CD62L-Percp/Cy5.5抗体（克隆DREG-56） | BioLegend | 304824 | |
| Tim-3-PE-Cy7抗体（克隆F38-3E2） | BioLegend | 345014 | |
| CD4-PE-Dazzle594抗体（克隆A161A1） | BioLegend | 357412 | |
| CD8-APC抗体（克隆RPA-T8） | BioLegend | 301049 | |
| CD3-AF700抗体（克隆OKT3） | BioLegend | 317340 | |
| CD39-APC-Cy7抗体（克隆A1） | BioLegend | 328226 | |
| LAG3-BV421抗体（克隆11C3C65） | BioLegend | 369314 | |
| CD45RA-Brilliant Violet 605抗体（克隆HI100） | BioLegend | 304134 | |
| PD-1-BV711抗体（克隆EH12.2H7） | BioLegend | 329722 | |
| CD8-BUV737抗体（克隆SK1） | BD | 612755 | |
| 流式活性染料 | Ghost Dye™ Violet 510活性染料 | TONBO | 13-0870-T100 |
| 细胞计数 | CountBright绝对计数微球 | Invitrogen | C36995 |
| CAR检测 | 人FGFR4-Fc嵌合蛋白 | Abcam | ab83999 |
| 生物素化人B7-H3（4Ig）/B7-H3b蛋白 | Acro Biosystem | B73-H82F5 | |
| 流式二抗 | R-藻红蛋白标记链霉亲和素 | -- | -- |
| AF647标记的人IgG-Fc特异性Fab | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-607-008 | |
| TIL分离 | Percoll密度梯度离心液 | Cytiva | 17089102 |
| CITE-Seq | TotalSeq-C人冻干抗体panel | BioLegend | -- |
| Chromium单细胞5'解决方案v2平台 | 10× Genomics | -- | |
| CITE-Seq测序 | Illumina NextSeq500测序仪 | Illumina | -- |
| 细胞因子刺激 | FGFR4-Fc嵌合蛋白 | Abcam | ab83999 |
| CD276-Fc嵌合蛋白 | Acro Biosystem | B73-H82F5 | |
| Western blot | Pierce RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| Halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78442 | |
| 4–12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | NP0336 | |
| 抗磷酸化CD3ζ（Y142）抗体（克隆EP265(2)Y） | Abcam | 1b68235 | |
| 抗磷酸化Zap-70（Tyr319）/Syk（Tyr352）抗体（克隆65E4） | Cell Signaling Technology | 2717 | |
| 抗Zap-70抗体（克隆L1E5） | Cell Signaling Technology | 2709 | |
| 抗磷酸化PLCγ1（Tyr783）抗体（克隆D6M9S） | Cell Signaling Technology | 14008 | |
| 抗PLCγ1抗体（克隆D9H10） | Cell Signaling Technology | 5690 | |
| 抗磷酸化ERK1/2（T202/Y204）抗体（克隆D13.14.4E） | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 抗磷酸化Akt（Ser473）抗体（克隆D9E） | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 抗Akt（pan）抗体（克隆C67E7） | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 抗磷酸化NF-κB p65（Ser536）抗体（克隆93H1） | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗NF-κB p65抗体（克隆D14E12） | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗CD3ζ抗体（克隆6C10.2） | Santa Cruz Biotechnology | SC-1239 | |
| ECL Prime化学发光检测试剂 | Amersham | RPN2232 | |
| CAR构建 | 快速T4 DNA连接试剂盒 | Takara | -- |
| 无缝克隆和组装试剂盒 | GeneArt, Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞毒性实验 | 效靶比（1:8、1:10或1:1）、靶细胞接种密度（1E+4/孔）、共培养时间（20、44或68小时）、T细胞供体来源 阅读提示：Methods中Cytotoxicity assay of CAR T-cells小节及图1B、图3F、图6B–D图注 |
| 体内原位异种移植模型 | 细胞接种数量（RH30 1E+6、RMS559 2E+6、JR 3E+6）、接种部位（肌内）、CAR T细胞输注剂量（1E+6、2.5E+6或10E+6）、输注时间（肿瘤接种后7或14天）、小鼠品系（NSG）及性别周龄 阅读提示：Methods中Xenograft mouse models小节及图1D、H，图3G，图4A、G图注 |
| 细胞因子产生实验 | FGFR4-Fc/CD276-Fc包被浓度（系列稀释，0.00625 μM起）、刺激时间（20小时）、T细胞数量（1E+4/孔）、检测试剂盒 阅读提示：Methods中Cytokine production stimulated by FGFR4 or CD276 proteins小节及图7A–C图注 |
| Western blot信号通路检测 | CAR T细胞数量（2E+6）、血清饥饿时间（4小时）、抗原刺激浓度（1 μg/ml）、交联抗体浓度（5 μg/ml）、刺激时间点（5、15、30分钟） 阅读提示：Methods中Activation of CAR T-cells for western-blotting assay小节及图7D图注 |
| CRISPR-KO异质性验证 | gRNA序列、单克隆筛选、体外效靶比（1:1）、双侧肿瘤模型接种方案、CAR T细胞剂量（2.5E+6） 阅读提示：Methods中Cell lines, cell culture, CDX and PDX tumors小节及图6A、E图注 |
| CITE-Seq | TIL分离时间（输注后11天）、分选标记（CD45+）、hashtag抗体、表面蛋白panel、测序平台及数据分析流程 阅读提示：Methods中Single-cell analysis of CAR TILs using cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-Seq)小节及图5A图注 |