NRP1在肾损伤后远端小管中的表达验证
验证NRP1在AKI和CKD中是否上调及细胞定位
对I-R不同时间点小鼠肾脏进行scRNA-seq，FISH和免疫荧光检测Nrp1与Cdh16共定位；免疫荧光检测I-R、UUO、5/6肾切除模型中Nrp1表达；肾移植患者活检样本免疫荧光检测NRP1。
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靶向远端小管跨膜细胞因子共受体神经纤毛蛋白-1可改善肾损伤和纤维化
Targeting the transmembrane cytokine co-receptor neuropilin-1 in distal tubules improves renal injury and fibrosis.
实验完整度
高包含患者样本、小鼠I-R/UUO/5/6Nx模型、多种基因敲除小鼠、体外pTECs、scRNA-seq及修饰蛋白质组学，并有功能与机制验证。
主要模型
肾移植术后肾功能不全患者肾活检样本 小鼠双侧肾缺血再灌注（I-R）损伤模型 小鼠单侧输尿管梗阻（UUO）模型 小鼠5/6肾切除模型 原代肾小管上皮细胞（pTECs）
重点核对
小鼠I-R模型：肾蒂夹闭30分钟，再灌注后5天和14天检测 Nrp1在肾小管上皮细胞特异性敲除（Nrp1flox/+;Ksp-iCre）及他莫昔芬诱导 pTECs氧糖剥夺/复氧（OGD/R）：1% O2 6小时，复氧6小时 肾移植患者样本分组：eGFR <30 vs ≥30 ml/min/1.73 m2，NRP1高/低按中位数划分 Cox4i1 K29R突变质粒转染pTECs及TUNEL检测
摘要
神经纤毛蛋白-1（NRP1）是包括TGF-β在内的多种细胞因子的共受体，已被确定为纤维化的潜在治疗靶点。然而，其在肾纤维化中的作用和机制仍不清楚。在此，我们发现NRP1在移植肾功能不全患者和肾缺血再灌注（I-R）损伤小鼠的远端小管（DT）细胞中表达上调。敲除Nrp1可减少肾损伤和纤维化的多个终点。我们发现，肾损伤后Nrp1促进TNF-α与其受体在DT细胞中的结合。该信号传导导致代谢酶Cox4i1的赖氨酸巴豆酰化下调，降低细胞能量代谢并加剧肾损伤。此外，通过单细胞RNA测序，我们发现Nrp1阳性DT细胞分泌胶原并与肌成纤维细胞通讯，通过激活Smad3加剧急性肾损伤（AKI）诱导的肾纤维化。在DT细胞中同时基因敲除Nrp1和Tgfbr1比任一单独敲除更能改善肾损伤和纤维化。总之，这些结果表明靶向NRP1是治疗AKI及后续慢性肾脏病的一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NRP1在肾纤维化中的作用和机制尚不清楚，本研究旨在探讨远端小管NRP1在肾损伤和纤维化中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- NRP1作为TNF-α受体Tnr1a的共受体，促进TNF-α结合，激活Nfkb1并抑制Etv6转录，降低Acox3表达，减少Cox4i1 K29巴豆酰化，损害线粒体功能导致细胞死亡；同时NRP1与Tgfbr1协同激活Smad3，促进胶原分泌和肌成纤维细胞活化，加剧纤维化。
- 主要证据
- 在I-R、UUO和5/6肾切除小鼠模型中，肾小管特异性敲除Nrp1减轻肾损伤和纤维化；scRNA-seq显示Nrp1+ DT细胞与肌成纤维细胞通讯增强；修饰蛋白质组学揭示Cox4i1 K29巴豆酰化变化；双敲除Nrp1和Tgfbr1效果优于单敲除。
- 研究意义
- 靶向NRP1是治疗AKI及后续慢性肾脏病的一种有前景的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Nrp1在远端小管中对肾损伤和纤维化的功能影响
确定远端小管Nrp1是否促进肾损伤和纤维化
使用Nrp1flox/+;Ksp-iCre小鼠在TEC中特异性敲除Nrp1，诱导I-R、UUO和5/6肾切除模型，检测肾功能、组织病理学和纤维化标志物；并用lentivirus过表达Nrp1。
NRP1通过TNF-α/Tnr1a-Nfkb1-Etv6-Acox3轴调控Cox4i1巴豆酰化
阐明NRP1调控线粒体代谢和细胞死亡的分子机制
scRNA-seq分析转录因子活性；CUT&RUN-qPCR验证Nfkb1结合Etv6启动子；Western blot检测Kcr水平；修饰蛋白质组学鉴定Cox4i1 K29巴豆酰化；构建Cox4i1 K29R突变质粒转染pTECs，检测线粒体功能和凋亡。
NRP1+ DT细胞与肌成纤维细胞通讯促进纤维化
探究NRP1+ DT细胞促进肾纤维化的细胞间通讯机制
scRNA-seq细胞通讯分析（Cellchat）；ECM评分；检测Nrp1+ DT细胞中ECM相关基因和肌成纤维细胞标志物； bulk RNA-seq和pTECs蛋白质组学验证ECM蛋白表达。
双敲除Nrp1和Tgfbr1对肾损伤和纤维化的协同改善
验证同时靶向NRP1和TGF-β受体是否更有效
构建Tgfbr1单敲除和Nrp1/Tgfbr1双敲除小鼠（Tgfbr1flox/+,Ksp-iCre和Nrp1/Tgfbr1flox/+,Ksp-iCre），诱导I-R后14天检测肾功能和纤维化；并用siRNA在体内敲低Nrp1和Tgfbr1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肾功能检测 | QuantiChrom™肌酐检测试剂盒 | BioAssay Systems | -- |
| QuantiChrom™尿素检测试剂盒 | BioAssay Systems | -- | |
| 免疫荧光 | Nrp1抗体 | Abcam | ab81321 |
| Nrp1抗体 | R&D Systems | FAB5994P | |
| Nrp1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5307 | |
| Kim1抗体 | R&D Systems | AF1817 | |
| S12a3抗体 | Abcam | ab95302 | |
| Tgfr1抗体 | Proteintech | 30117-1-AP | |
| Tnr1a抗体 | Abcam | ab223352 | |
| 荧光原位杂交 | Nrp1探针 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | -- |
| Cdh16抗体 | Proteintech | 15107-1-AP | |
| Western blot | Nrp1抗体 | Abcam | ab81321 |
| Tnr1a抗体 | Abcam | ab223352 | |
| Cox4i1抗体 | CST | 4850 | |
| Nfkb1抗体 | CST | 13586 | |
| Smad3抗体 | CST | 9523 | |
| Pdgfrb抗体 | Abcam | ab69506 | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 | |
| β-actin抗体 | CST | 4967 | |
| 泛巴豆酰化抗体 | Jingjie PTM BioLab | PTM-502 | |
| ELISA | 小鼠KIM1 ELISA试剂盒 | Boster Biological Technology | -- |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录系统 | Vazyme | -- | |
| SYBR预混液 | Vazyme | -- | |
| Step-One实时PCR系统 | ABI | -- | |
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| Falcon细菌培养皿 | Corning | 351029 | |
| Falcon 100 mm细胞培养皿 | Corning | 353003 | |
| OGD/R处理 | 无糖培养基 | Gibco | 11966-025 |
| Seahorse分析 | Seahorse XFe24分析仪 | Agilent | -- |
| Seahorse XF DMEM检测培养基 | Agilent | 103680-100 | |
| TUNEL染色 | CoraLite 594 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | Proteintech | -- |
| 线粒体染色 | MitoTracker Green | Beyotime | -- |
| CUT&RUN | Hyperactive pG-MNase CUT&RUN qPCR检测试剂盒 | Vazyme | HD101 |
| 质粒构建与转染 | pcDNA3.1(+)-Cox4i1(K29R)-3flag质粒 | GenScript Biotech Corporation | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | -- |
| siRNA | Tgfr1 siRNA | RiboBio | -- |
| Tnr1a siRNA | RiboBio | -- | |
| 单细胞悬液制备 | 多组织解离试剂盒 | Miltenyi | 130-110-203 |
| Countess自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 | |
| 单细胞RNA测序 | 10x Chromium单细胞仪器 | 10x Genomics | -- |
| Illumina Novaseq 6000平台 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Exploris 480串联质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 修饰蛋白质组学 | timsTOF Pro 2质谱仪 | Bruker | -- |
| 动物实验 | 温度控制器 | FHC | -- |
| 小鼠动脉夹 | Roboz Surgical Instrument Co | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠I-R模型 | 肾蒂夹闭时间30分钟，再灌注后5天和14天检测；小鼠品系C57BL/6，8-12周龄，雄性；体温维持36.6-37.2°C 阅读提示：Methods中Animal model部分 |
| Nrp1条件性敲除 | Nrp1flox/+;Ksp-iCre小鼠，他莫昔芬诱导敲除；对照为vehicle处理；基因型验证 阅读提示：Methods中Mice部分和Results中Nrp1 in distal TECs部分 |
| pTECs分离与OGD/R | 0.2% IV型胶原酶消化1小时；OGD/R：无糖培养基+1% O2 6小时，复氧6小时 阅读提示：Methods中Isolation and culture of pTECs和Oxygen glucose deprivation/reoxygenation部分 |
| Cox4i1 K29R突变实验 | pcDNA3.1(+)-Cox4i1(K29R)-3flag质粒转染pTECs；TUNEL检测凋亡；MitoTracker检测线粒体 阅读提示：Methods中Construction of plasmids and cell transfection和TUNEL部分 |
| 肾移植患者样本分析 | 217例肾移植术后肾功能不全患者，eGFR <30 vs ≥30 ml/min/1.73 m2分组；NRP1高/低按中位数划分；伦理批号TJ-IRB20230446 阅读提示：Methods中Ethics statement和Results中Nrp1 expression increases部分 |