人hPGCLC诱导模型验证REV1需求
验证TLS核心组分REV1是否参与人原始生殖细胞样细胞诱导。
在携带BLIMP1-tdTomato和TFAP2C-EGFP报告基因的BTAG iPSCs中敲除REV1，经iMeLC诱导后分化为hPGCLCs，并通过流式细胞术和免疫荧光检测。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
原始生殖细胞DNA去甲基化与发育需要DNA跨损伤合成
Primordial germ cell DNA demethylation and development require DNA translesion synthesis.
实验完整度
高含人iPSC诱导hPGCLC体外模型、多种小鼠遗传模型、WGBS及功能与机制验证
主要模型
人BTAG iPSCs诱导的hPGCLCs Rev1-/-、Rev7-/-、PcnaK164R/K164R、Rev1AA、Rev1CT等突变小鼠胚胎 E12.5小鼠性腺及FACS纯化的PGCs
重点核对
REV1-/-与野生型hPGCLC诱导频率（3个独立克隆，至少3次独立实验） Rev1-/-、Rev7-/-、PcnaR/R胚胎E8.5-E12.5 PGC数量（GOF18-GFP/SSEA1流式） 成年突变小鼠与野生型交配的生育力及性腺质量/组织学 E12.5 PGCs的WGBS及LINE-1、GRR基因位点亚硫酸氢盐测序 E12.5 PGCs的EdU掺入、ɣ-H2A.X、RPA、pCHK2、pH3、cyclin B1和CC3检测
摘要
DNA损伤应答（DDR）因子突变与人类不育相关，影响高达15%的人群。DDR在生殖细胞发育和减数分裂过程中是必需的。与人类生育力相关的一个通路是DNA跨损伤合成（TLS），它允许复制障碍被绕过。我们发现TLS对胚胎中减数分裂前生殖细胞的发育至关重要。中心TLS组分REV1的缺失显著抑制人PGC样细胞（hPGCLCs）的诱导。这在小鼠中得以重现，其中TLS起始（Rev1-/-或PcnaK164R/K164R）或延伸（Rev7-/-）的缺陷导致原始生殖细胞（PGCs）数量减少>150倍并完全不育。相反，TLS的缺失不影响体细胞的生长、功能或稳态。令人惊讶的是，我们发现生殖细胞转录程序的激活和DNA去甲基化（种系表观遗传重编程的关键步骤）均完全失败。我们的发现表明，对于正常生育力，DNA修复不仅需要用于减数分裂重组，还需要用于哺乳动物生殖细胞发育最早阶段的进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TLS通路是否以及如何参与哺乳动物原始生殖细胞（PGC）的胚胎发育和生育力维持？
- 核心机制
- REV1的C端蛋白互作结构域、REV7及PCNA K164修饰所代表的TLS功能是PGC发育所必需的；TLS缺失导致PGCs积累未解决的DNA损伤、增殖减少、G2/M期阻滞和凋亡，并阻止生殖细胞转录程序激活及全基因组DNA去甲基化。
- 主要证据
- 人hPGCLC诱导模型显示REV1缺失降低hPGCLC频率；小鼠Rev1-/-、Rev7-/-和PcnaK164R/K164R胚胎E12.5 PGCs减少>150倍且成年不育；E12.5突变PGCs显示DNA损伤标志物增加、EdU掺入减少、pH3和核cyclin B1增加、CC3增加；WGBS和位点亚硫酸氢盐测序显示突变PGCs保留DNA甲基化，且GRR基因表达降低。
- 研究意义
- 研究提出TLS是哺乳动物胚胎生殖细胞发育和表观遗传重编程的关键保障，为理解人类不育的胚胎起源提供了新的机制方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠TLS缺陷模型的生育力与性腺表型分析
确定TLS因子缺失是否导致小鼠不育及生殖细胞丢失。
将Rev1-/-、PcnaR/R、Rev7-/-等小鼠与野生型交配，统计后代；分析成年性腺质量、H&E组织学、PLZF免疫组化及卵泡计数。
胚胎PGC数量与发育时序分析
确定TLS缺陷导致PGC减少的胚胎时间窗口和程度。
利用GOF18-GFP或Stella-GFP报告基因，在E8.5-E12.5通过荧光成像和流式细胞术（SSEA1+GFP+）定量PGCs。
REV1结构域功能解析
区分REV1催化活性与C端蛋白互作结构域在PGC发育中的作用。
构建Rev1AA（催化失活）和Rev1CT（C端100氨基酸缺失）小鼠，与GOF18-GFP报告基因杂交，在E12.5定量PGCs并评估成年生育力。
TLS缺陷PGC的DNA损伤、增殖与凋亡检测
阐明TLS缺失导致PGC池收缩的细胞学机制。
在E12.5性腺切片中免疫染色检测ɣ-H2A.X、RPA32、pCHK2、CC3、EdU、pH3和cyclin B1，并定量阳性PGC频率。
PGC转录程序与DNA甲基化分析
验证TLS缺失是否阻断PGC发育相关的转录和表观遗传重编程。
对E12.5 FACS纯化的PGCs进行RT-qPCR、ddPCR、WGBS和位点特异性亚硫酸氢盐测序，分析生殖细胞基因表达及CpG甲基化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| hiPSC培养 | Stemfit Basic04培养基 | Amsbio | SFB-504-CT |
| Geltrex基质 | Life Technologies | A1413302 | |
| Accutase细胞消化液 | Millipore | SF006 | |
| Y-27632 rock抑制剂 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| iMeLC诱导 | 激活素A | R&D | 338-AC-010 |
| CHIR99021 | Cambridge Bioscience | SM13-5 | |
| hPGCLC诱导 | 白血病抑制因子 | Millipore | LIF1005 |
| 骨形态发生蛋白4 | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| 干细胞因子 | R&D Systems | 255-SC-050 | |
| 表皮生长因子 | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| hPGCLC免疫染色 | 抗OCT4抗体 | Abcam | ab181557 |
| 抗TFAP2C抗体 | Santa Cruz | sc-12762 | |
| 抗SOX17抗体 | R&D | AF1924 | |
| MEF转化 | pBABE-SV40-Puro质粒 | -- | -- |
| 聚凝胺 | Millipore | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96水溶性细胞增殖检测试剂 | Promega | -- |
| 免疫组化 | 抗PLZF抗体 | -- | sc-28319 |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 免疫荧光 | 抗GFP抗体 | Nacalai | GF090Rl |
| 抗磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体 | Millipore | 05-636 | |
| 抗cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗RPA抗体 | Cell Signaling Technology | 2208 | |
| 抗cyclin B1抗体 | Cell Signaling Technology | 4138 | |
| 抗磷酸化CHK2（Thr68）抗体 | Cell Signaling Technology | 2661 | |
| 抗TET1抗体 | Abcam | ab272901 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9701 | |
| 流式分析 | 抗SSEA1-Alexa Fluor 647抗体 | Biolegend | MC-480 |
| RNA提取与反转录 | PicoPure RNA分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SuperScript IV逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ddPCR | ddPCR探针预混液 | BioRad | -- |
| 单细胞基因表达分析 | 单细胞到CT试剂盒 | ThermoFisher | 4458237 |
| 亚硫酸氢盐测序 | EZ DNA甲基化直接试剂盒 | Zymo Research | D5020 |
| pGEM-T Easy载体系统I | Promega | -- | |
| EdU检测 | Click-iT Plus EdU细胞增殖成像试剂盒（Alexa Fluor 594） | Thermo Fisher Scientific | C10639 |
| 血清激素检测 | Milliplex Map小鼠垂体磁珠面板 | Millipore | MPTMAG-49K |
| Demeditec Diagnostics大鼠/小鼠ELISA试剂盒 | Demeditec Diagnostics | DEV9911 | |
| 免疫印迹 | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab8227 | |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine转染试剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hPGCLC诱导与REV1缺失验证 | BTAG iPSC克隆、REV1敲除克隆数、hPGCLC诱导第4天流式检测、3次独立分化实验 阅读提示：Methods中“Induction of iMeLCs and hPGCLCs”及“Flow cytometry analysis of hPGCLC aggregates”；Fig. 1b, c |
| 小鼠TLS突变模型构建与基因型 | Rev1-/-、Rev1AA、Rev1CT、PcnaK164R/K164R、Rev7-/-等等位基因构建方式及C57BL/6J背景 阅读提示：Methods中“Generation of PcnaK164R, Rev1AA and Rev1CT mutant mice”及“Mice”；Supplementary Fig. 2和4 |
| 胚胎PGC流式定量 | E8.5-E12.5胚胎取材时间、GOF18-GFP/SSEA1双阳性门控、各基因型样本量 阅读提示：Methods中“Preparation of PGCs and their quantification and isolation by flow cytometry”；Fig. 1m,n、Fig. 3l,m |
| EdU体内掺入与细胞周期检测 | EdU 50 mg/kg单次腹腔注射、注射后4小时取材、E12.5性腺固定与Click-iT检测 阅读提示：Methods中“EdU incorporation analysis in vivo”；Fig. 4e |
| WGBS与位点亚硫酸氢盐测序 | E12.5 FACS纯化PGCs、E6.5外胚层对照数据来源、WGBS建库方法、LINE-1/Dazl/Mili位点引物 阅读提示：Methods中“Whole genome Bisulfite sequencing”和“Bisulfite sequencing”；Fig. 5c-g、Supplementary Fig. 9和10 |
| 成年小鼠生育力与性腺组织学 | 8-12周龄成年小鼠、与野生型异性交配3个月、交配栓观察、性腺质量及H&E/PLZF染色 阅读提示：Methods中“Assessing fertility of mice”和“Histological analysis”；Fig. 1e-j、Fig. 3a-h |