检测BACH1在肥胖和NAFLD肝脏中的表达
评估BACH1表达是否与代谢紊乱相关。
分析公开单细胞转录组数据、NAFLD患者肝组织qRT-PCR/Western blot/免疫组化，以及HFD、ob/ob、db/db小鼠肝脏和OA/PA处理的原代肝细胞中BACH1表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
BACH1调控小鼠肝脏胰岛素信号和葡萄糖稳态
BACH1 controls hepatic insulin signaling and glucose homeostasis in mice.
实验完整度
高包含患者肝组织、多种小鼠模型、原代肝细胞和细胞系，并完成功能与机制验证（co-IP、GST pull-down等）
主要模型
高脂饮食喂养的肝细胞特异性Bach1敲除（Bach1LKO）及过表达（Bach1LTG）雄性小鼠 db/db糖尿病雄性小鼠 原代小鼠肝细胞 HepG2、HEK293T、C2C12及3T3-L1细胞系 NAFLD患者及肥胖个体肝组织样本
重点核对
HFD喂养12周，Bach1LKO与Bach1fl/fl对照组每组n=8，检测空腹血糖、胰岛素、GTT、ITT和HOMA-IR 胰岛素刺激后检测肝脏IR-β、AKT、GSK-3β和FOXO1磷酸化水平，每组n=6 co-IP检测HFD小鼠肝脏及原代肝细胞中PTP1B与IR-β的相互作用 AAV-shPtpn1肝脏敲低PTP1B后检测Bach1LTG小鼠代谢表型及胰岛素信号 db/db小鼠注射AAV-shBach1四周后行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验
摘要
肝脏胰岛素抵抗是代谢综合征的核心。本文研究BTB和CNC同源蛋白1（BACH1）在肝脏胰岛素信号中的作用。BACH1在肥胖个体和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者的肝细胞中升高。在高脂饮食（HFD）雄性小鼠中敲除肝细胞特异性Bach1可改善高血糖和胰岛素抵抗、改善葡萄糖稳态并防止脂肪变性，而雄性小鼠肝脏过表达Bach1则导致相反的表型。BACH1直接与蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）和胰岛素受体β（IR-β）相互作用，且BACH1缺失在胰岛素刺激下减少PTP1B与IR-β的相互作用并增强肝细胞中的胰岛素信号。抑制PTP1B显著减弱HFD喂养雄性小鼠中BACH1介导的胰岛素信号抑制。肝脏BACH1敲低可改善糖尿病雄性小鼠的高血糖和胰岛素敏感性。这些结果证明肝脏BACH1在胰岛素信号和葡萄糖稳态调控中的关键功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BACH1是否以及如何调控肝脏胰岛素信号和葡萄糖稳态。
- 核心机制
- BACH1通过其BTB结构域直接结合PTP1B和IR-β，促进PTP1B与IR-β的相互作用，从而抑制胰岛素信号；该作用至少部分依赖PTP1B。
- 主要证据
- 在HFD喂养的Bach1LKO和Bach1LTG小鼠、db/db小鼠、原代肝细胞及HepG2细胞中，BACH1缺失增强胰岛素刺激的IR-β/AKT/GSK-3β/FOXO1磷酸化并改善糖耐量和胰岛素敏感性；co-IP和GST pull-down证实BACH1与PTP1B及IR-β直接结合；PTP1B敲低或抑制可逆转BACH1的作用。
- 研究意义
- 提示BACH1是肝脏胰岛素信号和葡萄糖代谢的关键调控因子，可能成为糖尿病等代谢疾病治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝细胞特异性Bach1敲除小鼠的代谢表型
验证BACH1缺失对HFD诱导的胰岛素抵抗和葡萄糖稳态的影响。
AAV8-TBG-Cre注射Bach1flox/flox小鼠生成Bach1LKO，HFD或CD喂养12周，检测体重、肝重、空腹血糖/胰岛素、GTT、ITT、糖原含量、糖异生基因及胰岛素信号蛋白磷酸化。
肝细胞特异性Bach1过表达小鼠的代谢表型
验证BACH1过表达对HFD诱导的胰岛素抵抗和脂肪变性的影响。
AAV8-TBG-Cre注射loxP-Bach1转基因小鼠生成Bach1LTG，HFD或CD喂养12周，检测代谢指标、糖原含量、糖异生基因及胰岛素信号。
BACH1对肝细胞胰岛素信号的直接调控
在体外验证BACH1对胰岛素信号通路的影响。
分离Bach1LKO和Bach1LTG小鼠原代肝细胞，以及在HepG2、C2C12、3T3-L1细胞中敲低或过表达BACH1，胰岛素刺激后检测IR-β、AKT、GSK-3β、FOXO1磷酸化。
BACH1与PTP1B及IR-β的相互作用及结构域定位
明确BACH1是否直接结合PTP1B和IR-β以及介导结合的结构域。
co-IP、免疫荧光共定位、GST pull-down及截短体（ΔBTB、ΔBzip）实验检测BACH1与PTP1B、IR-β、PTEN、PP2A的相互作用。
BACH1增强胰岛素刺激下PTP1B与IR-β的相互作用
验证BACH1对PTP1B-IR-β复合物形成的影响。
HFD喂养Bach1LKO与对照小鼠胰岛素注射后肝脏co-IP检测PTP1B与IR-β结合；HepG2细胞中过表达BACH1后免疫荧光检测IR-β与PTP1B-D181A共定位。
PTP1B依赖性验证
确定BACH1抑制胰岛素信号是否依赖PTP1B。
原代肝细胞中BACH1过表达联合PTP1B siRNA或抑制剂；Bach1LTG小鼠注射AAV-shPtpn1后HFD喂养12周，检测代谢表型和胰岛素信号。
BACH1敲低对糖尿病小鼠的作用
验证肝脏BACH1敲低对db/db糖尿病小鼠高血糖和胰岛素抵抗的影响。
4周龄雄性db/db小鼠注射AAV-shBach1，CD喂养4周，检测空腹血糖、GTT、ITT、高胰岛素-正葡萄糖钳夹、肝糖原和糖异生基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | AAV8-TBG-Cre腺相关病毒 | Vigene Biosciences | -- |
| AAV-shPtpn1腺相关病毒 | Gene Pharma | -- | |
| 高脂饲料 | Shuyishuer Biotechnology Co. Ltd | D12492 | |
| 葡萄糖 | Macklin Inc. | D810588 | |
| 胰岛素 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 代谢指标检测 | 血糖试纸 | Roche Diabetes Care GmbH | -- |
| 糖原测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A043-1-1 | |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-3 | |
| 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-3 | |
| 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A059-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-2 | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-2 | |
| 非酯化脂肪酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A042-1 | |
| 血清胰岛素检测试剂盒 | Abcam | ab277390 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Life Technologies | 12800082 |
| 胎牛血清 | Gbico | 10099-141 | |
| 牛血清白蛋白 | Yeasen | 36101ES25 | |
| 细胞处理 | 棕榈酸 | Sigma–Aldrich | P0500 |
| 油酸 | Sigma–Aldrich | O1008 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma–Aldrich | A9576 | |
| 转染 | Lipofectamine™ 3000转染试剂 | Gbico | L3000075 |
| jetPEI转染试剂 | Polyplus-transfection SA | 24765-1 | |
| Opti-MEM培养基 | Gbico | 31985088 | |
| RNA提取与qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒 | Toyobo | FSQ-101 | |
| qPCR SYBR® Green预混液 | Toyobo | QPK-201 | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G PLUS琼脂糖 | Santa Cruz | SC-2003 |
| 免疫组化 | BACH1抗体 | Proteintech | 14018-1-AP |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | 31430 | |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| DAB显色液 | Zhongshan Biotech | ZLI-9032 | |
| 免疫荧光 | 抗LC3抗体 | Cell Signaling Technology | 3868 |
| 抗ERp57抗体 | Proteintech | 15967-1-AP | |
| 抗BACH1抗体 | Proteintech | 14018-1-AP | |
| 抗GFP抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| DAPI染料 | Sigma–Aldrich | D9542-1MG | |
| Triton X-100 | Sigma–Aldrich | T9284 | |
| Western blot | PMSF | Beyotime | ST505 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MedCheExpress | HY-K0010 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| ECL检测试剂 | Tanon | 180-5001 | |
| BODIPY染色 | BODIPY 493/503染料 | MedChemExpress | -- |
| 质粒构建 | pLV3-CMV-MCS-TagBFP载体 | MiaoLingBio | P50405 |
| pCDNA3.1-Cherry载体 | MiaoLingBio | P1737 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HFD小鼠模型建立 | HFD配方（20% kcal蛋白、60 kcal%脂肪、20% kcal碳水化合物）、喂养时长12周、小鼠性别和周龄（雄性8周龄，20 g） 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Supplementary Fig. 3a |
| Bach1LKO和Bach1LTG小鼠构建 | AAV8-TBG-Cre剂量（1×10^11病毒颗粒，100 μl尾静脉注射）、基因型对照（Bach1fl/fl或NTG）、每组n=8 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Supplementary Fig. 2a、4a |
| 胰岛素信号检测 | 胰岛素注射剂量0.75 IU/kg、腹腔注射后10分钟取材、过夜禁食、检测的磷酸化蛋白（IR-β、AKT、GSK-3β、FOXO1） 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Fig. 2h、3h图注 |
| PTP1B敲低 rescue实验 | AAV-shPtpn1剂量（1×10^11病毒颗粒）、HFD喂养12周、四组分组（NTG/Bach1LTG × AAV-TBG-GFP/AAV-shPtpn1） 阅读提示：Methods中Animals and treatment小节及Fig. 7图注 |
| db/db小鼠BACH1敲低及钳夹实验 | db/db小鼠周龄（4周龄，30 g）、AAV-shBach1注射后CD喂养4周、钳夹实验胰岛素输注速率1.2 mU/kg/min、示踪剂3-[3H]-D-葡萄糖方案 阅读提示：Methods中Animals and treatment及Hyperinsulinemic-euglycemic clamping小节，Fig. 8图注 |
| 细胞实验胰岛素刺激 | 胰岛素浓度100 nM、刺激时间10分钟、梯度胰岛素25~200 nM、腺病毒感染MOI-20及48小时 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment及Constructions and transfections小节，Fig. 4图注 |