精原细胞瘤单细胞转录组图谱构建
解析精原细胞瘤组织中的主要细胞类型和免疫浸润情况
对4例成人精原细胞瘤组织分离单细胞，10x Genomics平台scRNA-seq，质控后对10,817个细胞进行UMAP降维聚类和标记基因注释，并用IHC验证主要细胞类型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人睾丸生殖细胞肿瘤的单细胞多组学分析揭示其分子特征与微环境
Single-cell multi-omics analysis of human testicular germ cell tumor reveals its molecular features and microenvironment.
实验完整度
高含单细胞多组学、空间转录组、CUT&Tag、细胞系siRNA功能验证及IHC/IF、流式等多层证据
主要模型
精原细胞瘤患者肿瘤组织（n=4） 人精原细胞瘤细胞系TCam-2 外周血单个核细胞来源的CD19+ B细胞
重点核对
scRNA-seq纳入4例精原细胞瘤样本，10,817个细胞通过质控 TCam-2中siRNA敲低TFAP2C，敲低组表达下降>50% Transwell迁移与侵袭实验处理48 h，结晶紫染色计数 B细胞经10 ng/mL重组人MIF处理48 h，末24 h加100 ng/mL LPS 空间转录组使用3例样本切片，10x Visium平台
摘要
精原细胞瘤是14至44岁男性中最常见的恶性实体瘤。然而，其分子特征和肿瘤微环境（TME）在很大程度上尚未被探索。在此，我们通过基因组学分析（单细胞多组学和空间转录组学）以及使用精原细胞瘤样本和精原细胞瘤细胞系进行功能检测，开展了一系列研究。我们识别了精原细胞瘤与原始生殖细胞共享的关键基因表达程序，并进一步表征了TFAP2C在促进肿瘤侵袭和迁移中的功能。我们还识别了TME中的15种免疫细胞亚型，并通过联合空间转录组分析发现具有耗竭特征的亚型位于更靠近肿瘤区域的位置。此外，我们识别了可能促进精原细胞瘤扩散至生精小管之外的关键通路和基因。这些发现推进了我们对精原细胞瘤肿瘤发生的认识，并提供了原位人精原细胞瘤微环境的多组学图谱，这可能有助于发现精原细胞瘤的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 精原细胞瘤的分子特征、肿瘤微环境组成及其与原始生殖细胞的关系和肿瘤进展机制尚不清楚，本研究旨在回答这些问题。
- 核心机制
- 精原细胞瘤与PGCs共享TFAP2C、POU5F1、NANOG、SOX17等关键多能性与生殖系特化因子表达；TFAP2C通过直接调控FOSL1、LYPD3、ITGA6等基因促进迁移和侵袭；肿瘤细胞经MIF-(CD74+CXCR4)与免疫细胞通讯，巨噬细胞表达MMP9和CTSK可能帮助肿瘤突破生精小管。
- 主要证据
- 对4例精原细胞瘤样本的scRNA-seq、3例样本的空间转录组、scATAC-seq、TCam-2细胞siRNA敲低后的迁移侵袭和RNA-seq/CUT&Tag、IHC/IF验证及B细胞与MIF共培养流式检测支持上述结论。
- 研究意义
- 研究推进了对精原细胞瘤肿瘤发生和原位微环境的认识，提供了多组学图谱，并可能有助于发现精原细胞瘤的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
精原细胞瘤与早期生殖细胞比较
探索精原细胞瘤的分子特征及可能起源
提取375个肿瘤细胞，与已发表的成人健康生殖细胞数据及PGCs、fetal state 0-like细胞、adult spermatogonial states数据整合，进行PCA、相关分析和K-means聚类，比较共享基因表达程序。
空间转录组验证关键基因定位
在组织空间层面验证TFAP2C、SOX17等关键基因在精原细胞瘤区域的表达
使用10x Visium平台对3例精原细胞瘤组织切片进行空间转录组分析，检测关键基因表达及通路空间分布。
scATAC-seq解析染色质可及性与关键转录因子
从染色质可及性层面识别精原细胞瘤特异的关键转录因子及其结合motif
对1例肿瘤样本（3个重复）和1例健康对照睾丸样本（2个重复）进行scATAC-seq，ArchR降维聚类，基于启动子基因评分注释细胞类型，MACS2/3调用peak并做motif富集分析。
TFAP2C功能验证
验证TFAP2C对精原细胞瘤细胞迁移、侵袭和增殖的影响
在TCam-2细胞中用siRNA敲低TFAP2C，qRT-PCR检测敲低效率，Transwell实验检测迁移和侵袭，结晶紫染色计数，并检测增殖。
TFAP2C下游机制解析
解析TFAP2C直接调控的靶基因及通路
对siTFAP2C和siNC组进行RNA-seq差异表达分析，并在TCam-2细胞中做CUT&Tag捕获TFAP2C结合基因，取交集鉴定直接激活基因并做GO富集。
免疫细胞亚型与空间分布分析
解析精原细胞瘤微环境中免疫细胞亚型组成、状态及与肿瘤的空间关系
重新聚类T细胞和B细胞，鉴定亚型及标记基因，Monocle拟时序分析，整合scRNA-seq与空间转录组定位亚型，IHC验证CD3和PDCD1，并用TCGA队列做生存分析。
巨噬细胞MMP9/CTSK与肿瘤突破生精小管
探索精原细胞瘤突破生精小管的相关分子机制
利用空间数据识别肿瘤边缘富集通路，分析MMP9和CTSK表达细胞类型及与巨噬细胞空间位置的相关性，IF验证MMP9/CTSK与CD68共定位，并做生存分析。
MIF信号通路介导肿瘤-免疫通讯
探索精原细胞瘤与免疫细胞之间的细胞通讯机制
CellChat分析配体-受体互作，空间数据和IF验证MIF与CD74表达定位，体外用MIF处理B细胞并通过流式检测活化标志CD69和CD137。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本冻存 | 冻存管 | Corning | -- |
| DMEM培养基 | Life Technologies | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8779 | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 异丙醇冻存盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组化 | 抗CD45抗体 | Proteintech | 20103-1-AP |
| 抗VIM抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 T | |
| 抗NANOG抗体 | Abcam | ab109250 | |
| 抗OCT4抗体 | Santa | sc-5279 | |
| 抗CD3抗体 | MXB Biotechnologies | MAB-0740 | |
| 抗PDCD1抗体 | ProMab Biotechnologies | P04417 | |
| 抗TFAP2C抗体 | Proteintech | 14572-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗SOX17抗体 | R&D systems | AF1924 |
| 抗CD19抗体 | Abcam | ab134114 | |
| 抗CD68抗体 | Proteintech | 66231-2-Ig | |
| 抗MMP9抗体 | Proteintech | 10375-2-AP | |
| 抗CTSK抗体 | Proteintech | 11239-1-AP | |
| 抗MIF抗体 | Proteintech | 20415-1-AP | |
| 抗CD74抗体 | Proteintech | 66390-1-Ig | |
| 细胞培养 | MycoAlertTM PLUS支原体检测试剂盒 | Lonza Bioscience | LT07-710 |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10099141 C | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | 15140122 | |
| siRNA转染 | Lip3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与逆转录 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 逆转录 | Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | ROCHE | 04897030001 |
| 细胞侵袭 | BD Matrigel基质胶 | BD | -- |
| B细胞分离 | 淋巴细胞分离液 | STEMCELL Technologies | -- |
| MojoSort™人泛B细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480082 | |
| B细胞处理 | 重组人MIF蛋白 | peprotech | 300-69-5 |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式分析 | Zombie Aqua可固定活性染料试剂盒 | Biolegend | 423101 |
| APC标记抗人CD19抗体 | Biolegend | 302212 | |
| PE-Cy7标记抗人4-1BB抗体 | Biolegend | 309817 | |
| Brilliant Violet 421标记抗人CD69抗体 | BD | 562884 | |
| 单细胞样本制备 | IV型胶原酶 | Sigma Aldrich | -- |
| DNase I | Sigma Aldrich | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | -- | |
| 40 µm细胞筛 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| D-PBS | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| scRNA-seq建库 | Chromium Next GEM单细胞3′试剂盒v3.1 | 10X Genomics | -- |
| Chromium Next GEM芯片G | 10X Genomics | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme Biotech | TD903 |
| 抗TFAP2C抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-12762 | |
| 正常小鼠IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| CUT&Tag建库 | TD202 TruePrep索引试剂盒V2 | Vazyme | TD202 |
| CUT&Tag纯化 | VATHS DNA纯化磁珠 | Vazyme Biotech | N411 |
| scATAC-seq建库 | DNBelab C系列单细胞ATAC文库制备试剂盒 | MGI | 1000021878 |
| 细胞重悬缓冲液 | MGI | -- | |
| Qubit单链DNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 精原细胞瘤单细胞转录组图谱 | 样本量n=4；质控标准>500表达基因且线粒体reads<25%；10,817个细胞；UMAP使用top 2000高变基因和1-30 PCs 阅读提示：Methods中“Processing of single cell RNA-seq data”及Fig. 1b图注 |
| 精原细胞瘤与PGCs比较 | 肿瘤细胞数（正文375个与图注n=5163 cells存在差异）；正常生殖细胞来源GEO:GSE120508；比较的细胞状态 阅读提示：Results“Seminoma and PGCs shared expression”及Fig. 2a图注 |
| 空间转录组验证 | 样本量3例；10x Visium平台；约6403 spots；DV200≥50% 阅读提示：Methods“10X Visium library generation”及Fig. 2g图注 |
| scATAC-seq | 肿瘤样本1例3重复、健康对照1例2重复；24,005个细胞；参考基因组hg38；peak calling软件与motif分析参数 阅读提示：Methods“Single-cell ATAC–seq library generation”与“scATAC-seq data analysis” |
| TFAP2C敲低功能实验 | TCam-2细胞；siRNA序列；敲低效率>50%；Transwell迁移/侵袭48 h；迁移侵袭重复数n=5；双侧Wilcoxon秩和检验 阅读提示：Methods“Cell culture and small interfering RNA”与“Cell migration”“Cell invasion”，Fig. 3g、h图注 |
| TFAP2C下游机制 | RNA-seq差异基因数（下调843、上调498）；CUT&Tag结合基因n=4906；直接激活基因n=346；CUT&Tag细胞数1×10^5；抗体sc-12762与IgG对照sc-2025 阅读提示：Methods“CUT&Tag library generation”及Fig. 3i–k图注 |
| 免疫细胞亚型与空间定位 | 免疫细胞10,672个；CD8+ n=2382、CD4+ n=2840；样本量4；IHC验证4例；生存分析基于TCGA TGCT队列 阅读提示：Fig. 4a、f、g图注及Results“Immune cell infiltration in seminoma” |
| MMP9/CTSK与巨噬细胞 | 空间转录组3例；IF样本n=3；MMP9与巨噬细胞相关P=2.08E–296、CTSK与巨噬细胞P=5.01E–32；单尾配对t检验 阅读提示：Fig. 5b–g图注及Results相应段落 |
| MIF信号与B细胞共培养 | PBMC经Lymphoprep密度梯度离心；CD19+ B细胞分离试剂盒480082；MIF 10 ng/mL处理48 h；末24 h加LPS 100 ng/mL；流式重复n=6；抗体货号与稀释比 阅读提示：Methods“B cells isolation and co-culture with MIF”与“Flow cytometry”，Fig. 6f图注 |