E-cadherin CTD与AnkG R1-24结合亲和力及化学计量表征
验证E-cadherin与AnkG的直接相互作用并确定结合化学计量。
纯化E-cadherin CTD（734-884）和AnkG R1-24（38-855）蛋白，进行ITC测定结合Kd，并用AGFC分析1:1混合后的复合物峰。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
E-cadherin与Ankyrin-G之间的动态相互作用介导上皮细胞极性维持
Dynamic interactions between E-cadherin and Ankyrin-G mediate epithelial cell polarity maintenance.
实验完整度
高体外表征蛋白纯化复合物互作、细胞功能验证AnkG结合缺陷突变对侧膜定位和极性的影响，涵盖多个证据层级。
主要模型
MDCK细胞系（稳定表达E-cadherin shRNA） HEK293细胞系 大肠杆菌BL21 (DE3)表达系统
重点核对
ITC测定E-cadherin CTD与AnkG R1-24结合Kd约1.3 μM，表观N值约0.22，提示非1:1化学计量 AGFC偶联静态光散射显示E-cadherin CTD与AnkG R1-24形成1:1至1:2异质性复合物 NMR滴定中E-cadherin CTD残基751-777和829-867的酰胺峰强度显著下降 MDCK细胞中稳定敲低E-cadherin>80%，回补野生型及突变体后统计细胞质/膜荧光比值和侧膜高度 ITC证实E-cadherin CTD、AnkG R1-24和β-catenin可形成三元复合物
摘要
E-cadherin是一种必需的细胞间黏附蛋白，在上皮细胞侧膜中介导经典的cadherin-catenin复合物形成。Ankyrin-G（AnkG）是一种将膜蛋白与基于血影蛋白的细胞骨架连接的支架蛋白，与E-cadherin协同维持上皮细胞极性。然而，调控该复合物形成的分子机制及其与cadherin-catenin复合物的关系仍不清楚。在此，我们报道AnkG以混杂方式利用同一区域包裹E-cadherin的三个离散位点，这是一种动态机制，不同于先前描述的其他AnkG或E-cadherin介导复合物的经典1:1摩尔比。此外，我们证明AnkG结合缺陷型E-cadherin在侧膜积累存在缺陷，并表明破坏相互作用导致细胞极性功能障碍。最后，我们证明E-cadherin能够同时锚定AnkG和β-catenin，为ankyrin-spectrin复合物与cadherin-catenin复合物的功能协同编排提供了机制见解。总之，我们的结果表明E-cadherin与AnkG之间的复合物形成是动态的，通过确保黏附分子-支架蛋白复合物的忠实靶向，从而维持上皮细胞极性，为细胞-细胞连接处必需的E-cadherin介导的复合物组装提供了分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- E-cadherin如何通过其胞质尾协调与AnkG、β-catenin、p120 catenin等多种结合蛋白的复合物形成，以及这些复合物是互斥还是可同时形成功能复合物。
- 核心机制
- AnkG通过其ANK重复（R8-14）上的同一浅口袋，以动态竞争方式混杂结合E-cadherin CTD的三个离散位点（位点1：755-770；位点2：828-842；位点3：854-869），形成1:1至1:2的动态“模糊”复合物；疏水相互作用（E-cadherin芳香族残基）是复合物组装的关键。
- 主要证据
- ITC、AGFC-静态光散射、NMR（HSQC滴定和甲基-TROSY）显示E-cadherin CTD与AnkG R1-24结合Kd约1.3 μM，形成1:1和1:2复合物；MDCK细胞中AnkG结合缺陷型E-cadherin（位点1、2、3三重突变）侧膜定位缺失、侧膜高度降低，而其他突变体保留膜积累。
- 研究意义
- 揭示E-cadherin–AnkG复合物的动态相互作用机制，为理解上皮细胞极性维持中E-cadherin介导的复合物组装提供分子机制，并为相关疾病蛋白复合物的研究提供结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NMR鉴定E-cadherin CTD上的AnkG结合区域
确定E-cadherin CTD中参与AnkG结合的残基区域。
对15N标记的E-cadherin CTD进行HSQC滴定，加入未标记AnkG R1-24（50 μM和100 μM），分析酰胺峰强度变化和化学位移扰动。
ITC定位E-cadherin CTD的三个离散AnkG结合位点
通过截短片段确定E-cadherin CTD中与AnkG结合的具体位点。
设计E-cadherin CTD截短片段，用ITC测定各片段与AnkG R1-24的结合亲和力，鉴定位点1（755-770）、位点2（828-842）和位点3（854-869）。
AGFC-静态光散射分析E-cadherin CTD与AnkG R1-24复合物化学计量
确定E-cadherin CTD与AnkG R1-24形成的复合物种类和比例。
将E-cadherin CTD与AnkG R1-24按1:1、1:2、1:3、1:4摩尔比混合，用AGFC偶联静态光散射和示差折射检测器分析分子量和复合物分布。
ITC验证E-cadherin芳香族残基突变对AnkG结合的影响
确定E-cadherin位点中芳香族残基对AnkG结合的必要性。
构建E-cadherin位点1、2、3的芳香族残基丙氨酸突变体，用ITC测定其与AnkG R1-24的结合亲和力；并构建全长CTD的单点、双点和三点突变体进行ITC。
甲基-TROSY NMR解析AnkG结合口袋及动态竞争机制
确定AnkG上E-cadherin结合口袋，并验证三个位点在AnkG同一区域动态竞争结合。
制备Met-13CH3标记的AnkG R8-24，与E-cadherin CTD或单个位点融合表达，采集1H-13C甲基-TROSY谱，分析化学位移扰动模式。
ITC评估E-cadherin突变体对β-catenin和p120 catenin结合的影响
确认E-cadherin芳香族突变不影响经典cadherin-catenin复合物结合。
用ITC测定β-catenin 1-781和p120 catenin 324-938与E-cadherin CTD野生型及7种突变体的结合亲和力。
MDCK细胞中E-cadherin突变体侧膜定位和AnkG招募分析
验证AnkG结合缺陷对E-cadherin侧膜积累和AnkG定位的影响。
在MDCK细胞中稳定敲低E-cadherin（shRNA效率>80%），转染GFP-E-cadherin WT或7种突变体，免疫荧光染色E-cadherin、AnkG和actin，共聚焦显微镜成像并定量细胞质/膜荧光比值和侧膜高度。
AGFC-静态光散射和ITC验证E-cadherin-AnkG-β-catenin三元复合物
确定E-cadherin能否同时结合AnkG和β-catenin形成三元复合物。
将AnkG R1-24、E-cadherin CTD和β-catenin 1-781按1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1摩尔比混合，AGFC-静态光散射分析复合物分子量；并用ITC滴定E-cadherin CTD-AnkG复合物与β-catenin的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白-蛋白相互作用和结合亲和力
解析蛋白复合物结构和动态构象
验证细胞定位和功能
检测蛋白表达
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | 镍离子亲和琼脂糖柱 | -- | -- |
| Superdex 200凝胶过滤柱 | -- | -- | |
| Superdex 75凝胶过滤柱 | -- | -- | |
| HRV 3C蛋白酶 | -- | -- | |
| ITC | Microcal VP-ITC量热仪 | Malvern | -- |
| AGFC-静态光散射 | AKTA快速蛋白液相色谱系统 | GE Healthcare | -- |
| miniDawn静态光散射检测器 | Wyatt | -- | |
| Optilab示差折光检测器 | Wyatt | -- | |
| Superdex 200 increase色谱柱 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 慢病毒感染 | Lipo 3000转染试剂 | -- | -- |
| 聚凝胺 | Sigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 兔抗E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP |
| 抗AnkG抗体 | Life Technologies | 4G3F8 | |
| Alexa Fluor 647-鬼笔环肽 | Invitrogen | A22287 | |
| Western blot | 兔抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP |
| 免疫荧光 | 兔抗p120 catenin抗体 | Proteintech | 12180-1-AP |
| 兔抗β-catenin抗体 | CST | 8480 | |
| 小鼠抗α-catenin抗体 | Thermo Fisher Scientific | 13-9700 | |
| Alexa Fluor 488、568或647偶联的山羊二抗 | Thermo Fisher | -- | |
| 4ʹ,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma | -- | |
| 免疫荧光成像 | Zeiss激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 880 |
| NMR | Bruker Avance 600光谱仪（配备冷冻探头） | Bruker | -- |
| 15NH4Cl | Cambridge Isotope Laboratories (CIL) | -- | |
| 13C-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories (CIL) | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ITC测定E-cadherin与AnkG结合 | 蛋白浓度：Trx-E-cadherin 200 μM，Trx-AnkG R1-24 20 μM；缓冲液pH 7.8；温度25 °C 阅读提示：Methods中Isothermal titration calorimetry (ITC) assay小节 |
| AGFC-静态光散射分析复合物化学计量 | E-cadherin浓度70 μM；AnkG浓度70/140/210/280 μM；摩尔比1:1、1:2、1:3、1:4 阅读提示：Methods中Fast protein liquid chromatography coupled with static light scattering小节及Fig. 2d–h图注 |
| MDCK细胞E-cadherin敲低和回补实验 | shRNA序列5’-GCAGCATGATGTTCACTATCA-3’；敲低效率>80%；转染GFP-E-cadherin WT或突变体；聚凝胺8 µg/ml；puromycin筛选 阅读提示：Methods中shRNA and lentiviral infection小节及Fig. S8a, b |
| 免疫荧光染色和定量 | 抗体稀释比例：抗E-cadherin 1:500 IF，抗AnkG 1:500 IF，Phalloidin 1:1000 IF；固定3.7% PFA 10分钟；透化0.2% Triton X-100 8分钟；Z轴扫描间隔0.5 μm 阅读提示：Methods中Antibodies and immunofluorescence imaging小节及Fig. 6、Fig. 7图注 |
| NMR甲基-TROSY分析AnkG结合口袋 | AnkG R8-24浓度约100 μM；Met-13CH3标记；缓冲液100 mM磷酸盐，100 mM NaCl，pH 7.2；温度298 K 阅读提示：Methods中NMR experiments小节及Fig. 4图注 |