DC特异性Zeb1条件敲除小鼠构建与表型分析
确定Zeb1在DC中的缺失效率及对DC各亚群数量分布的影响
构建exon 4两侧带LoxP的Zeb1fl/fl小鼠并与CD11c-cre杂交；免疫印迹验证缺失特异性；流式细胞术分析脾脏、pLN、胸腺、肝、肺cDC1、cDC2、pDC频率与绝对数，并进行scRNA-seq聚类分析
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转录因子Zeb1调控1型经典树突状细胞的稳态与功能
The transcription factor Zeb1 controls homeostasis and function of type 1 conventional dendritic cells.
实验完整度
高结合DC特异性条件敲除小鼠、混合骨髓嵌合体、单细胞测序、RNA-seq、miRNA-seq、CUT&Tag及体内感染和肿瘤模型，并包含Cybb回补和miR过表达的功能验证
主要模型
Zeb1fl/fl CD11c-cre小鼠（Zeb1-dcKO）骨髓来源Flt3L培养cDC1与cDC2 B6.SJL受体混合骨髓嵌合体小鼠 B16F10黑色素瘤皮下移植模型 L. monocytogenes静脉感染小鼠模型
重点核对
Zeb1-dcKO经CD11c-cre在CD11c+ DC中特异性缺失，免疫印迹证实而T、B细胞未缺失 体内感染剂量1×10^6 CFU（存活）或2.5×10^4 CFU（菌载量）L. monocytogenes静脉注射 B16F10皮下注射2×10^5细胞，第12–14天采集肿瘤分析浸润免疫细胞 混合骨髓嵌合体按B6:WT或B6:KO 1:1共5×10^6细胞移植，8周后分析 体外交叉呈递：1×10^4 cDC与2.5×10^4 CFSE标记OT-I/OT-II共培养3天，加不同剂量HKLM-OVA或OVA
摘要
1型经典树突状细胞（cDC1）是诱导保护性细胞毒性T细胞反应最有效的交叉呈递细胞。然而，其稳态和功能的调控机制尚不完全清楚。本研究发现，在树突状细胞中缺失Zeb1的小鼠，其脾脏cDC1选择性减少并伴随过度细胞死亡，使小鼠对李斯特菌感染更具抵抗力。此外，来自Zeb1缺陷小鼠其他来源的cDC1对外源性抗原的交叉呈递受损，削弱了抗肿瘤CD8+ T细胞反应。机制上，Zeb1抑制靶向NADPH氧化酶Nox2的Cybb mRNA的microRNA-96/182的表达，从而促进活性氧依赖的吞噬体膜破裂，使抗原得以输出至胞质。在Zeb1缺陷的cDC1中重新表达Cybb可完全恢复缺陷的交叉呈递，而在Zeb1充足的cDC1中过表达microRNA-96/182则抑制交叉呈递。因此，本研究结果鉴定了一条控制cDC1交叉呈递的Zeb1-microRNA-96/182-Cybb通路，并揭示了Zeb1在cDC1稳态中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Zeb1如何调控1型经典树突状细胞的稳态及其对外源抗原的交叉呈递功能
- 核心机制
- Zeb1直接抑制miR-183-96-182簇转录，解除miR-96/182对Cybb mRNA 3'UTR的抑制，维持Nox2来源的吞噬体ROS产生，促进吞噬体膜破裂和抗原输出至胞质，从而支持交叉呈递
- 主要证据
- Zeb1-dcKO小鼠脾脏cDC1选择性减少伴Annexin V+7-AAD+死亡细胞增加、对李斯特菌更抵抗；B16F10肿瘤生长加快且瘤内CD8+ T细胞效应功能下降；Zeb1缺陷Flt3L-cDC1交叉呈递缺陷、吞噬体ROS减少、galectin-3招募和CCF4裂解减少；Cybb回补完全恢复交叉呈递，miR-96过表达抑制交叉呈递
- 研究意义
- 鉴定Zeb1-miR-96/182-Cybb轴控制cDC1交叉呈递，揭示Zeb1在cDC1稳态中的关键作用，并提示进一步研究Zeb1机制或可为增强cDC1抗肿瘤免疫效力提供新的治疗靶点
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脾脏cDC1减少的细胞内在性与死亡机制验证
判断cDC1减少源于发育缺陷还是稳态/存活异常及是否为细胞内在效应
检测骨髓和脾脏pre-DC亚群；Flt3L体外培养BM细胞观察DC发育；Annexin V/7-AAD、active caspase-3、Ki67染色；构建1:1混合骨髓嵌合体并进行竞争重建分析
李斯特菌感染模型中的宿主防御评估
检验脾脏cDC1减少对李斯特菌感染抵抗力的影响及固有免疫反应是否完整
静脉感染L. monocytogenes，观察存活、脾和肝菌载量、H&E组织病理及血清细胞因子ELISA；并用TLR配体刺激Flt3L-cDC检测细胞因子产生
B16F10肿瘤模型中抗肿瘤免疫与cDC1交叉呈递功能评估
检验Zeb1缺失对cDC1交叉呈递及抗肿瘤CD8+ T细胞反应的影响
皮下接种B16F10黑色素瘤细胞，监测肿瘤生长和存活，分析肿瘤及dLN中cDC亚群和T细胞浸润与效应分子；进行脾切除对照；体内OT-I交叉呈递实验及体外HKLM-OVA、OVA-β2m−/−细胞、可溶OVA、SIINFEKL刺激的交叉呈递实验
转录组与Zeb1结合图谱鉴定靶基因
解析Zeb1调控交叉呈递的转录程序和直接靶基因
对HKLM-OVA刺激前后的WT与Zeb1缺陷Flt3L-cDC1进行bulk RNA-seq、miRNA-seq和CUT&Tag，结合KEGG、GSEA和IGV分析；双荧光素酶报告验证miR-96/182对Cybb 3'UTR的靶向
ROS产生、吞噬体膜破裂与抗原输出的功能验证
验证Zeb1通过Cybb/miR-96/182影响吞噬体ROS、膜破裂及抗原向胞质输出
检测胞内和线粒体ROS（CellROX、MitoSOX）及吞噬体ROS（OxyBURST/Alexa Fluor 647-HKLM-OVA）；DPI抑制Nox2；galectin-3招募共聚焦成像；CCF4-β-lactamase和DQ-OVA检测抗原输出与降解；phago-lysosome融合FRET及flow organellocytometry
Cybb回补与miR-96/182过表达的功能挽救实验
确定Zeb1-miR-96/182-Cybb通路的因果作用
在Zeb1-dcKO BM Lin−c-Kithi细胞中用慢病毒表达Cybb，在WT细胞中用逆转录病毒过表达miR-96或miR-182，经Flt3L培养分选cDC1后行交叉呈递实验
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织白细胞分离 | 胶原酶D | Roche | 1108888200 |
| DNase I | Roche | 1010415900 | |
| IV型胶原酶 | Sigma | C4-BIOC | |
| 抗原负载与检测 | 卵清蛋白 | Sigma | S7951 |
| 免疫印迹 | 抗鸡卵清蛋白抗体 | Sigma | C6534 |
| 吞噬与抗原呈递 | Alexa Fluor 488标记卵清蛋白 | Invitrogen | O34781 |
| Alexa Fluor 647标记卵清蛋白 | Invitrogen | O34784 | |
| HKLM-OVA荧光标记 | Alexa Fluor 647 NHS酯 | Invitrogen | A37573 |
| T细胞增殖示踪 | 羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | C34554 |
| Nox2抑制 | 二苯基碘鎓氯化物 | MEC | HY-100965 |
| 共聚焦成像 | mCherry:Galectin-3表达质粒 | Addgene | 85662 |
| 凋亡检测 | Annexin V凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 559763 |
| 活性Caspase-3凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 550914 | |
| 流式活性检测 | 可固定活性染料eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-18 |
| ELISA | 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00016 |
| 凋亡抑制 | Z-VAD-FMK | Calbiochem | -- |
| Smac模拟物 | APExBIO | SM164 | |
| 细胞富集 | Beaverbeads链霉亲和素磁珠 | Beaver | 22307 |
| 细胞分选 | DynaMag-2磁力架 | Invitrogen | 12321D |
| 流式分析 | FlowJo软件 | BD Biosciences | -- |
| 细胞内因子染色 | GolgiStop蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 554724 |
| 固定破膜 | Cytofix/Cytoperm固定破膜缓冲液 | BD Biosciences | 51-2090KZ |
| 抗原输出检测 | CCF4-AM荧光底物 | Invitrogen | K1095 |
| 抗原降解检测 | DQ标记卵清蛋白 | Invitrogen | D12053 |
| 蛋白酶体抑制 | MG132蛋白酶体抑制剂 | MCE | HY-13259 |
| 胞内ROS检测 | CellROX深红活性氧试剂 | Invitrogen | C10422 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Invitrogen | M36008 |
| 吞噬体ROS检测 | OxyBurst绿色H2DCFDA探针 | Invitrogen | D2935 |
| 吞噬体-溶酶体融合 | Alexa Fluor 594酰肼 | Invitrogen | A10438 |
| 双荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | E1910 |
| 单细胞测序 | BD单细胞多重标记试剂盒 | BD Biosciences | 633793 |
| BD Rhapsody芯片试剂盒 | BD Biosciences | 633731 | |
| BD Rhapsody靶向mRNA与AbSeq扩增试剂盒 | BD Biosciences | 633774 | |
| CUT&Tag | Hyperactive原位ChIP建库试剂盒 | Vazyme | TD901-01 |
| 抗Zeb1抗体 | Proteintech | 21544-1-AP | |
| 兔IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| 山羊抗兔IgG H&L二抗 | Abcam | ab6702 | |
| RNA提取 | RNeasy微型RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| miRNA逆转录 | TransScript miRNA第一链cDNA合成预混液 | Trans | AT351-01 |
| 免疫印迹 | Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- |
| 共聚焦成像 | Leica TCS SP8 DLS共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| Zeiss LSM 900+Airyscan2共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 电转 | Lonza核转染仪 | Lonza | AAB-1001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与基因型 | Zeb1fl/fl与CD11c-cre杂交背景（C57BL/6N来源Zeb1flox，Jackson CD11c-Cre #008068），对照为Zeb1fl/fl或Zeb1+/+ CD11c-cre同窝小鼠，8–12周龄 阅读提示：Methods的Mice小节及Supplementary Fig. 1a、1b |
| 脾脏cDC1与cDC2流式分析 | cDC门为L/D−Lin−MHC II+CD11c+CD317−Ly6C−，cDC1为XCR1+SIRPα−、cDC2为XCR1−SIRPα+；各组样本量（脾脏WT n=4、Zeb1-dcKO n=5等） 阅读提示：Fig. 1a–f图注与Methods的Flow cytometry and cell sorting小节，门控策略见Supplementary Fig. 9 |
| 混合骨髓嵌合体 | B6.SJL受体6.5 Gy亚致死照射，B6与WT或Zeb1-dcKO BM按1:1混合共5×10^6细胞静脉移植，8周后分析 阅读提示：Methods的Mixed bone marrow chimera小节与Fig. 1j–m图注 |
| 李斯特菌感染 | L. monocytogenes 10403S静脉注射剂量1×10^6 CFU（存活，n=10）或2.5×10^4 CFU（菌载量，n=5），感染后第2天取样 阅读提示：Methods的Listeria infection小节与Fig. 2图注 |
| B16F10肿瘤模型 | B16F10皮下注射2×10^5细胞，肿瘤体积按length×(width2)/2计算，肿瘤大小达2000 mm3为终点，第12–14天采集肿瘤 阅读提示：Methods的Tumor transplantation小节与Fig. 3图注 |
| 交叉呈递实验 | 体内免疫用5×10^5辐照（1500 rads）OVA负载β2m−/−脾细胞；体外1×10^4 cDC与2.5×10^4 CFSE-OT-I/OT-II共培养3天；HKLM-OVA剂量梯度 阅读提示：Methods的Antigen presentation assays小节与Fig. 4图注 |
| 吞噬体ROS与膜破裂检测 | OxyBURST/Alexa Fluor 647-HKLM-OVA孵育30或90 min；DPI 10 μM处理4 h；CellROX 5 μM 30 min、MitoSOX 5 μM 10 min；galectin-3共定位分析 阅读提示：Methods的ROS measurements与Immunofluorescence staining and confocal microscopy小节及Fig. 6图注 |
| Cybb回补与miR过表达 | Lin−c-Kithi细胞感染条件（2500 rpm、32°C、2 h；慢病毒2 μg/ml polybrene，逆转录病毒10 μg/ml polybrene），Flt3L培养9–11天后分选GFP+CD24+CD11c+ cDC1 阅读提示：Methods的Bone Marrow culture with Flt3L小节与Fig. 6a、6b |