筛选协同CDK4/6i并下调CDK6的化合物
寻找可降低CDK6表达并增强CDK4/6i疗效的化合物。
在A549和PC9细胞中用850种天然产物与ribociclib联合进行CDI协同筛选，再用免疫印迹筛选使CDK6蛋白下降超过50%的化合物。
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RNA结合蛋白LRPPRC促进肺癌对CDK4/6抑制的耐药
The RNA-binding protein LRPPRC promotes resistance to CDK4/6 inhibition in lung cancer.
实验完整度
高含体外细胞系、获得性耐药模型、CRISPR敲除、RIP-seq/ChIP/EMSA机制验证、异种移植与PDX体内验证及患者样本IHC
主要模型
A549和PC9肺腺癌细胞系 H1299和H460获得性耐ribociclib细胞系 A549皮下异种移植裸鼠模型 肺腺癌患者来源PDX模型
重点核对
A549和PC9为高CDK6:CDK4比、RB1功能完整且相对耐CDK4/6i的细胞系 获得性耐药细胞经ribociclib从500 nM逐步递增至20 μM长期培养建立 GAA处理浓度5 μM；ribociclib体内100 mg/kg灌胃每日每周5次 GAA脂质体10 mg/mL，每只200 μL尾静脉注射每三天一次 LRPPRC+/-与LRPPRC-/-单克隆经CRISPR-Cas9构建并以免疫印迹确认
摘要
针对细胞周期蛋白依赖性激酶4和6的激酶抑制剂（CDK4/6i）是有前景的癌症治疗药物。然而，其疗效因几乎所有肿瘤类型中存在的原发或获得性耐药而受限。在此，我们证明富含亮氨酸五肽重复序列蛋白（LRPPRC）通过与CDK6形成反馈环路来控制肺癌对CDK4/6i的应答。LRPPRC结合CDK6-mRNA，增加CDK6的稳定性和表达。CDK6及其下游E2F转录因子1（E2F1）结合LRPPRC启动子并提高LRPPRC转录。LRPPRC-CDK6环路的激活促进细胞周期G1/S转换、氧化磷酸化和癌症干细胞生成。醋酸棉酚（GAA）是一种被重新用作LRPPRC降解剂的妇科药物，在体外和体内增强CDK4/6i敏感性。我们的研究揭示了CDK4/6i耐药的机制，并为研究CDK4/6与LRPPRC抑制剂联合用于癌症治疗提供了启发性的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺癌中CDK6过表达及CDK4/6抑制剂耐药的机制是什么，能否通过干预该机制克服耐药。
- 核心机制
- LRPPRC结合CDK6 mRNA增强其稳定性并提高CDK6表达，CDK6与E2F1结合LRPPRC启动子促进LRPPRC转录，形成LRPPRC-CDK6正反馈环路，促进G1/S转换、OXPHOS和癌症干细胞生成。
- 主要证据
- RIP-seq/RIP-PCR显示LRPPRC结合CDK6 mRNA；ACTD稳定性实验显示LRPPRC维持CDK6半衰期；ChIP-PCR与EMSA显示CDK6和E2F1结合LRPPRC启动子；LRPPRC敲除或GAA处理降低CDK6并抑制G1/S转换、OXPHOS和干细胞标志；A549皮下瘤与PDX模型中GAA联合ribociclib抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示CDK4/6i耐药的正反馈机制，并提出CDK4/6i与LRPPRC降解剂GAA联合作为肺癌治疗的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立CDK4/6i获得性耐药细胞模型
模拟临床获得性耐药并评估GAA的逆转作用。
用H1299和H460细胞经ribociclib逐步递增浓度长期培养建立耐药细胞，检测IC50、CDK6与磷酸化RB1水平及GAA联合效果。
验证GAA靶向LRPPRC
确定GAA是否通过LRPPRC而非凋亡通路调节CDK4/6i敏感性。
荧光滴定检测LRPPRC与GAA结合，CETSA检测细胞内热稳定化，免疫印迹检测LRPPRC降解；并用LRPPRC敲除细胞比较GAA与ribociclib敏感性。
解析LRPPRC调控CDK6的分子机制
验证LRPPRC是否直接结合并稳定CDK6 mRNA。
RIP-seq鉴定LRPPRC结合RNA，RIP-PCR定量富集，ACTD实验检测CDK6 mRNA半衰期，并用R14适配体阻断C端结合。
验证CDK6和E2F1转录调控LRPPRC
验证反馈环路中CDK6和E2F1对LRPPRC启动子的转录激活。
ChIP-PCR检测CDK6和E2F1在LRPPRC启动子的富集，EMSA检测E2F1与启动子DNA直接结合，siRNA敲低CDK6或E2F1后检测LRPPRC表达。
评估LRPPRC-CDK6环路对OXPHOS和干细胞的作用
验证该环路是否通过OXPHOS和癌症干细胞促进耐药。
检测LRPPRC敲除或GAA处理后OXPHOS亚基表达、OCR/ECAR、中心碳代谢物及CD133+/CD44+干细胞比例和成球能力。
体内验证GAA联合CDK4/6i的疗效
验证联合治疗能否抑制LRPPRC-CDK6环路并增强体内抗肿瘤效果。
在A549皮下瘤和肺腺癌PDX模型中分组给予GAA脂质体、ribociclib或联合治疗，检测肿瘤体积、生存及IHC标志。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | #10099141 C | |
| pLentiCRISPR-E质粒 | Addgene | #78852 | |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 药物筛选 | 瑞博西利 | Meilunbio | #MB5136 |
| CCK8试剂盒 | Topscience | #C0005 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Applygen | #C1053-100 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Applygen | #P1266-1 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Applygen | #P1260-1 | |
| PVDF膜 | MERCK | #03010040001 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | #97166 | |
| 抗LRPPRC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | #sc-166178 | |
| 抗磷酸化RB1 Ser807/811抗体 | Cell Signaling Technology | #8516 | |
| 抗磷酸化RB1 Ser780抗体 | Cell Signaling Technology | #8180 | |
| 抗总OXPHOS抗体混合物 | Abcam | ab110413 | |
| 抗CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | #3136 | |
| 抗CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | #12790 | |
| 抗CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | #18048 | |
| 抗RB1抗体 | Cell Signaling Technology | #9313 | |
| 抗E2F1抗体 | Cell Signaling Technology | #3742 | |
| 抗CCNE1抗体 | Cell Signaling Technology | #20808 | |
| 抗PARP1抗体 | Cell Signaling Technology | #9542 | |
| 抗CASPASE 3抗体 | Cell Signaling Technology | #9662 | |
| 抗BCL2抗体 | Cell Signaling Technology | #4223 | |
| 抗CCNB1抗体 | Cell Signaling Technology | #12231 | |
| 抗PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| 抗α/β微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #2148 | |
| 抗β肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #3700 | |
| HRP标记二抗 | PROMEGA | W401B | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | #17-700 |
| 抗LRPPRC抗体 | Abcam | ab97505 | |
| miRNeasy微型试剂盒 | QIAGEN | #217004 | |
| 流式分析 | PE标记抗人CD133抗体 | Biolegend | #372804 |
| APC标记抗人CD44抗体 | BD Pharmingen | #559942 | |
| 碘化丙啶 | MERCK | #P4170 | |
| 核糖核酸酶A | MERCK | #RNASEA-RO | |
| 诺考达唑 | MERCK | #M1404 | |
| Yefluor 488 EdU成像试剂盒 | Yeasen | #40278ES25 | |
| DAPI | MERCK | #D9542 | |
| Annexin V凋亡检测试剂盒 | Yeasen Biotechnology | #40302ES60 | |
| 成球实验 | 表皮生长因子 | ABSIN | #abs04176 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | ABSIN | #abs04181 | |
| B27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | #15596026 | |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | Applygen | #C1260 |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | #L3000150 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | #15596026 |
| Hifair II第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | #11111ES92 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Yeasen | #11195ES03 | |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | #56383 |
| CDK6抗体 | Proteintech | 14052-1-AP | |
| EMSA | GST 4FF Sefinose树脂试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| IHC | 抗Ki67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型与耐药模型建立 | 细胞系来源与鉴定；A549、PC9为高CDK6:CDK4比且RB1功能完整的LUAD细胞；获得性耐药细胞ribociclib递增浓度与各阶段时长；耐药细胞维持浓度20 μM 阅读提示：Methods“Cell culture and treatment”与“Generation of cells with acquired resistance against CDK4/6i”，Fig. 1e及Supplementary Fig. S1、S3 |
| 药物联合处理 | GAA浓度5 μM；ribociclib浓度（体外4或5 μM；体内100 mg/kg灌胃每日每周5次）；GAA脂质体10 mg/mL每只200 μL尾静脉每三天一次；处理时间48小时或1-2周 阅读提示：Methods“Screening molecules harboring synergy effect with CDK4/6i”“Colony formation and cell proliferation assay”“Animal models”，Fig. 1b-d、Fig. 6a |
| LRPPRC敲除与敲低 | sgRNA/shRNA序列见Supplementary Data 1；嘌呤霉素筛选浓度2 μg/mL 72小时；单克隆敲除效率经免疫印迹确认；LRPPRC+/-与LRPPRC-/-克隆编号 阅读提示：Methods“Cell culture and treatment”，Fig. 2e及Supplementary Data 1 |
| RIP-seq与RIP-PCR | anti-LRPPRC抗体2 μg；对照为试剂盒内rabbit IgG；R14 1 μM与RTT 10 μM；RIP富集信号阈值FPKM>30 阅读提示：Methods“RIP-seq and RIP-PCR”，Fig. 3c-g及Supplementary Data 2 |
| ChIP-PCR与EMSA | 每反应2×10^6个A549细胞；CDK6或E2F1抗体各5 μg；阳性对照Histone H3抗体、阴性对照Normal Rabbit IgG；EMSA探针20 ng、GST-E2F1 25 °C 30分钟、竞争探针0.4 μg 阅读提示：Methods“Chip assay”与“Electrophoretic mobility shifts assay (EMSA)”，Fig. 4f、4h及Supplementary Data 1 |
| 体内药效实验 | 4-6周龄雌性BALB/c-Nu裸鼠；A549皮下瘤与PDX模型LP2；分组为对照、GAA、ribociclib、联合；每组6-7只（A549）或5-7只（PDX）；治疗4周；生存分析肿瘤体积阈值A549 150 mm3、PDX 500 mm3 阅读提示：Methods“Animal models”，Fig. 6a-c、6f-h及Supplementary Fig. S9 |
| 患者样本IHC | 乳腺癌患者接受palbociclib前活检样本；伦理批号IRB-2020-431；LRPPRC表达评分以>4为高表达、<4为低表达；PFS 12个月区分应答者；LRPPRC-low n=15、LRPPRC-high n=13，一线治疗亚组n=6和n=7 阅读提示：Methods“Human tissues and Immunohistochemistry (IHC)”，Fig. 2k、2l |