Nat10表达与定位分析
确定Nat10在小鼠卵母细胞发育中的表达模式与亚细胞定位
多组织Western blot、GSE71434 RNA-seq再分析、qPCR及NAT10与NPM共免疫荧光
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母源NAT10协调小鼠卵母细胞减数分裂细胞周期进程与成熟
Maternal NAT10 orchestrates oocyte meiotic cell-cycle progression and maturation in mice.
实验完整度
高包含Stra8-Cre与Zp3-Cre两种条件敲除小鼠模型、染色体铺展、RNA-seq、Ribo-seq及acRIP-seq等多层证据与功能验证
主要模型
Nat10-ScKO小鼠（Stra8-GFPCre条件敲除） Nat10-ZcKO小鼠（Zp3-Cre条件敲除） Nat10lox/lox; Ubc-CreERT2诱导型MEF细胞系 小鼠GV与MII期卵母细胞
重点核对
Nat10-ScKO与Nat10-ZcKO雌鼠与WT雄鼠交配6个月的生育力测试 染色体铺展SYCP1/SYCP3、γH2AX与RPA2免疫荧光计数 GV卵母细胞体外培养IBMX释放后GVBD与MII比例 PMSG/hCG超排卵后MII卵母细胞计数与纺锤体染色 HA-PAT检测GV与MII卵母细胞中靶转录本poly(A)尾长度
摘要
在哺乳动物中，成熟卵母细胞的产生需要在转录和转录后水平对不连续的减数分裂细胞周期进程进行严格调控。然而，这一复杂而明确的过程背后的因子在很大程度上仍不清楚。本文中，我们表征了N-乙酰转移酶10（Nat10）——RNA分子上N4-乙酰胞苷（ac4C）的书写器——在小鼠卵母细胞发育中的功能。我们提供遗传学证据表明，Nat10通过及时降解poly(A)尾mRNA来塑造母源转录组，从而对卵母细胞减数分裂前期I进程、卵母细胞生长和成熟至关重要。这是通过ac4C在关键CCR4-NOT复合体转录本上的沉积实现的。重要的是，我们设计了一种检测poly(A)尾长度（PAT）的方法，称为发夹接头-poly(A)尾长度（HA-PAT），其在成本、灵敏度和效率方面优于传统方法。总之，这些发现提供了遗传学证据，揭示了母源Nat10在卵母细胞发育中不可或缺的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Nat10是否以及如何通过ac4C修饰调控小鼠卵母细胞减数分裂细胞周期进程和母源转录组建立
- 核心机制
- Nat10通过沉积ac4C修饰维持CCR4-NOT去腺苷酸化酶复合体关键组分（Cnot6l、Cnot7、Btg4）的表达，促进母源poly(A) mRNA及时降解，从而塑造母源转录组
- 主要证据
- Stra8-Cre和Zp3-Cre条件敲除小鼠显示减数分裂前期I阻滞、卵泡发育停滞与雌性不育；染色体铺展显示DSB修复缺陷；mini-bulk SMART-seq2、HA-PAT与Ribo-seq显示母源mRNA降解延迟及翻译异常
- 研究意义
- 提供遗传学证据揭示母源Nat10在卵母细胞发育中不可或缺的作用，并建立更经济、灵敏、高效的HA-PAT方法用于poly(A)尾长度检测
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
减数分裂前Nat10敲除表型分析
验证Nat10在胚胎期生殖细胞中对减数分裂前期I进程的作用
Stra8-GFPCre介导Nat10条件敲除，生育力测试、卵巢形态与H&E组织学、减数分裂染色体铺展免疫荧光
出生后Nat10敲除表型分析
验证Nat10在卵母细胞生长与成熟中的作用
Zp3-Cre介导Nat10条件敲除，生育力测试、卵泡计数、GV卵母细胞NSN/SN染色质构型与H3K4me3/H3K9me3免疫荧光
GV-MII减数分裂成熟功能验证
检测Nat10缺失卵母细胞恢复减数分裂的能力
GV卵母细胞体外培养、超排卵后MII卵母细胞计数与α-tubulin染色、IVF胚胎发育观察
母源转录组与mRNA降解分析
解析Nat10缺失对母源转录组及mRNA降解的影响
GV与MII卵母细胞RNA-seq、mini-bulk SMART-seq2、qPCR验证及降解趋势分析
HA-PAT方法建立与poly(A)尾验证
开发低输入样本poly(A)尾长度检测方法并验证靶转录本降解缺陷
设计发夹接头HA-PAT，与LM-PAT和ePAT比较，检测GV与MII卵母细胞靶基因poly(A)尾长度
ac4C修饰与翻译调控分析
探究Nat10介导ac4C修饰与翻译效率的关系
低输入acRIP-seq、RIP-PCR验证、Ribo-seq及多组学联合分析
MEF细胞模型功能验证
在细胞模型中验证Nat10对细胞周期与翻译的作用
构建Nat10lox/lox; Ubc-CreERT2诱导型MEF，OHT诱导敲除与Nat10回补，检测增殖、凋亡、细胞周期与多聚核糖体谱
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001 | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 70 µm细胞筛网 | -- | -- | |
| 5% CO2细胞培养箱 | Heal Force | -- | |
| 慢病毒转导 | LlP2000转染试剂 | Biosharp | BL623B |
| 聚凝胺 | Solarbio | H8761 | |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | P8230 | |
| 卵母细胞收集与培养 | 孕马血清促性腺激素 | Ningbo Sansheng Pharmaceutical | -- |
| M2培养基 | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M1250 | |
| M16培养基 | Sigma | M7292 | |
| 矿物油 | Sigma | M5310 | |
| 显微镜SZX7 | Olympus | -- | |
| 超排卵与体外受精 | 人绒毛膜促性腺激素 | Ningbo Sansheng Pharmaceutical | -- |
| 透明质酸酶 | Sigma | H4272 | |
| KSOM培养基 | Sigma | MR-101 | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| SPARKeasy细胞RNA提取试剂盒 | Shandong Sparkjade Biotechnology Co., Ltd. | AC0205 | |
| NanoPhotometer N50微量核酸蛋白测定仪 | Implen | -- | |
| Hiscript III逆转录酶 | Vazyme | R302-1 | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11201ES03 | |
| Q2000B实时PCR仪 | LongGene | -- | |
| 组织学分析 | Bouin固定液 | -- | -- |
| 配MSX2相机的光学显微镜 | MShot | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| Trelief预染蛋白Marker | TSINGKE | TSP021 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 兔抗NAT10抗体 | ZENBIO | 389412 | |
| 鼠抗PCNA抗体 | Proteintech | 60097-1-Ig | |
| 鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 兔抗Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 兔抗CNOT6/6L抗体 | Abcam | ab86209 | |
| 兔抗CNOT7抗体 | ZENBIO | 382509 | |
| 兔抗BTG4抗体 | Abcam | ab235085 | |
| 成像系统 | SHST | -- | |
| 染色体铺展与免疫荧光 | 鼠抗SYCP3抗体 | Abcam | ab97672 |
| 兔抗SYCP1抗体 | Abcam | ab15090 | |
| 兔抗SYCP3抗体 | Proteintech | 23024-1-AP | |
| 鼠抗γH2AX抗体 | Millipore | 05-636 | |
| 兔抗RPA2抗体 | Proteintech | 10412-1-AP | |
| 正常山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| TRITC标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00007-2 | |
| 488标记二抗 | Proteintech | gb2AF488 | |
| 卵巢免疫荧光 | 兔抗NAT10抗体 | Proteintech | 13365-1-AP |
| 兔抗核磷蛋白抗体 | Abcam | ab10530 | |
| 兔抗H3K4me3抗体 | Abclonal | A2357 | |
| 兔抗α-Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 兔抗KI67抗体 | Servicebio | GB111141 | |
| Leica THUNDER活细胞成像仪配K5相机 | Leica | -- | |
| HA-PAT | SuperScript IV逆转录酶 | -- | -- |
| T4 DNA连接酶 | Sangon | B600511 | |
| ePAT | Klenow酶 | New England Biolabs | K0210 |
| 细胞增殖与凋亡 | 细胞计数试剂盒-8 | MedChemExpress | HY-K0301 |
| Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | YEASEN | 40302ES50 | |
| BD Accuri C6流式细胞仪 | BD | -- | |
| 多聚核糖体谱分析 | 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 11836170001 |
| RNase抑制剂 | APExBIO | K1046 | |
| ISCO组分收集器 | Teledyne ISCO | -- | |
| mini-bulk SMART-seq2 | Hieff NGS Illumina快速转座DNA文库构建试剂盒 | Yeasen | 12206ES96 |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Ribo-seq | RNase I | Invitrogen | AM2294 |
| T4多核苷酸激酶 | Yeasen | 12902ES86 | |
| 大肠杆菌poly(A)聚合酶 | Yeasen | 14801ES76 | |
| acRIP-seq | mRNA捕获磁珠 | Vazyme | R403-2 |
| RNA片段化试剂 | Thermo | AM8740 | |
| 蛋白A磁珠 | MedChemExpress | HY-K0203 | |
| 抗ac4C多克隆抗体 | Abcam | ab252215 | |
| 抗IgG多克隆抗体 | Proteintech | 30000-0-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 减数分裂前Nat10条件敲除 | Cre品系（Stra8-GFPCre）、激活时间（E12前后）、floxed外显子（E4/5）、生育力测试时长6个月及n=5 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 2a、2b、2e图注 |
| 出生后Nat10条件敲除 | Cre品系（Zp3-Cre）、激活阶段（初级卵泡）、P21 PMSG处理、生育力测试时长6个月及n=5 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 4a、4d图注 |
| GV卵母细胞体外成熟培养 | PMSG 5 IU注射后48 h取卵、IBMX释放、M16培养基、37 °C 5% CO2、GVBD 3 h与MII 16 h检测时间点 阅读提示：Methods中Oocyte collection and in vitro culture小节及Fig. 6a–c图注 |
| 超排卵与IVF | PMSG 5 IU、46 h后hCG 5 IU、hCG后15–16 h取卵、0.3%透明质酸酶、HTF与KSOM培养基 阅读提示：Methods中Superovulation and in vitro fertilization小节及Fig. 6d、6g图注 |
| mini-bulk SMART-seq2与HA-PAT | 每生物学重复5个卵母细胞、16 cycles PCR预扩增、TPM≥1与FC≥2阈值 阅读提示：Methods中Mini-bulk SMART-seq2与Poly(A)-tail length assay小节及Fig. 7、8图注 |
| acRIP-seq与Ribo-seq | 约2000个GV卵母细胞（acRIP-seq）、约100个卵母细胞（Ribo-seq）、ac4C/IgG>2阈值、anti-ac4C抗体ab252215 阅读提示：Methods中ac4C RNA immunoprecipitation and sequencing与Ribosome profiling and sequencing小节 |
| 诱导型MEF细胞模型 | E13.5胚胎、3T3 protocol、2 µM OHT处理3天、Nat10 ORF回补、多聚核糖体谱蔗糖梯度20–50% 阅读提示：Methods中Inducible Nat10 KO cell lines and culture与Polysome profiling小节及Fig. 9a图注 |