斑马鱼黑色素瘤单细胞转录组分析
鉴定黑色素瘤中不同的转录细胞状态，并分析黑色素细胞状态的代谢特征。
对TEAZ生成的BRAFV600Ep53-/-PTENko斑马鱼黑色素瘤进行scRNA-seq，聚类注释得到五个黑色素瘤细胞状态，并对黑色素细胞簇进行GSEA。
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脂滴是黑色素瘤的代谢脆弱点
Lipid droplets are a metabolic vulnerability in melanoma.
实验完整度
高包含斑马鱼模型、人细胞系、hPSC分化、患者数据集及体内功能验证
主要模型
斑马鱼TEAZ黑色素瘤模型 人黑色素瘤细胞系A375、RPMI-7951、A2058、SKMEL5、SKMEL28 人多能干细胞诱导分化的黑素母细胞和黑素细胞 斑马鱼ZMEL-LD细胞移植瘤模型
重点核对
斑马鱼TEAZ模型中dgat1a敲除（sgdgat1a）与对照（sgNT）的分组及肿瘤面积定量 人黑色素瘤细胞系经IBMX（200 µM）或Forskolin（20 µM）处理72小时诱导黑色素细胞状态 Seahorse Mito Stress Test中oligomycin 2.0 µM、FCCP 2.0 µM、rotenone/antimycin A 0.5 µM的使用 DGAT1抑制剂T863在斑马鱼胚盘移植实验中的剂量（1 µM和5 µM）及处理时长（72小时） 脂肪酸氧化测试中etomoxir 10 µM的使用及oleic acid（150 µM）与BSA对照
摘要
黑色素瘤表现出多种转录细胞状态，包括神经嵴样细胞以及色素性黑色素细胞。这些不同细胞状态与不同致瘤表型的关系仍不清楚。在此，我们使用斑马鱼黑色素瘤模型来鉴定一个将黑色素细胞状态与对脂滴（负责脂质储存的特化细胞器）的依赖联系起来的转录程序。对这些肿瘤的单细胞RNA测序显示，调控色素沉着的基因与参与脂质和氧化代谢的基因之间存在一致性。这种状态在人类黑色素瘤细胞系和患者肿瘤中保守。这种黑色素细胞状态表现出增加的脂肪酸摄取、增加的脂滴数量以及对脂肪酸氧化代谢的依赖。遗传和药理学抑制脂滴产生足以破坏细胞周期进程并在体内减缓黑色素瘤生长。由于黑色素细胞状态与患者的不良预后相关，这些数据表明黑色素瘤中存在一种依赖于脂滴细胞器的代谢脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黑色素瘤中色素性黑色素细胞状态如何与特定代谢依赖性相关联，以及靶向该代谢通路能否影响肿瘤生长。
- 核心机制
- 黑色素细胞状态上调脂肪酸摄取和氧化代谢，并通过DGAT1促进脂肪酸转化为甘油三酯储存于脂滴；抑制脂滴生成导致细胞周期进程受阻和氧化代谢紊乱。
- 主要证据
- 斑马鱼TEAZ黑色素瘤scRNA-seq显示黑色素细胞簇富集氧化磷酸化和脂肪酸代谢；人hPSC分化的黑素细胞及IBMX/Forskolin诱导的A375细胞显示OCR和OCR/ECAR升高；黑色素瘤细胞系中脂肪酸氧化基因评分和脂肪酸摄取速度最高；DGAT1敲除或抑制减少脂滴、降低肿瘤面积和细胞增殖。
- 研究意义
- 揭示了黑色素细胞状态与脂滴依赖之间的代谢脆弱性，提示脂滴生物合成通路可作为黑色素瘤的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人样本及细胞系中黑色素细胞状态代谢特征验证
验证斑马鱼中发现的黑色素细胞状态与氧化代谢的关联在人类中保守。
使用CCLE和TCGA黑色素瘤数据集分析脂肪酸氧化基因评分，并重新分析人黑色素瘤脑和软脑膜转移scRNA-seq数据。
人干细胞分化模型及A375细胞中氧化代谢功能验证
功能性地测试黑色素细胞状态是否伴随氧化代谢增强。
将BRAFV600E PTEN KO hPSC分化为黑素母细胞和黑素细胞，使用Seahorse Mito Stress Test测量OCR和ECAR；在A375细胞中用IBMX或Forskolin诱导黑色素细胞状态并测量OCR。
脂肪酸氧化和摄取功能评估
测试黑色素细胞状态是否增加脂肪酸作为氧化底物的利用和摄取。
在A375细胞中进行Seahorse脂肪酸氧化测试（±oleic acid、±etomoxir），并使用QBT Fatty Acid Uptake Assay测量脂肪酸摄取；在黑色素瘤细胞系中测量摄取速度。
脂滴生成和甘油三酯合成检测
评估黑色素细胞状态是否增加脂肪酸储存为甘油三酯和脂滴。
用oleic acid处理黑色素瘤细胞系，测量甘油三酯水平；用BODIPY C16和PLIN2抗体染色检测脂滴。
DGAT1缺失对脂滴和肿瘤生长的影响
测试抑制脂滴生成是否影响黑色素瘤进展和细胞周期。
在ZMEL-LD细胞中用CRISPR/Cas9敲除DGAT1或用DGAT1抑制剂处理，检测脂滴；在TEAZ模型中敲除dgat1a并测量肿瘤面积；进行胚盘移植实验并处理DGAT1抑制剂。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965 |
| 胎牛血清 | Gemini Bio | 100-500 | |
| 青霉素/链霉素/谷氨酰胺 | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| 斑马鱼肿瘤生成 | CM 830电方波发生器 | BTX Harvard Apparatus | -- |
| 斑马鱼成像 | Zeiss AxioZoom V16荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 斑马鱼胚盘移植 | DGAT1抑制剂T863 | Cayman Chemical Company | 25807 |
| 免疫组化 | BRAFV600E抗体 | Abcam | ab228461 |
| PLIN2抗体 | Proteintech | 15294-1-AP | |
| BOND聚合物精炼红检测试剂盒 | Leica Biosystems | DS9390 | |
| 单细胞RNA测序 | Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 |
| 3′ CellPlex试剂盒Set A | 10x Genomics | 1000261 | |
| UltraPure BSA | Thermo-Fisher | AM2616 | |
| BD FACSAria III细胞分选仪 | BD | -- | |
| Chromium单细胞3′文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | -- | |
| Chromium单细胞3′芯片G | 10x Genomics | -- | |
| NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| bulk RNA测序 | SMARTer通用低输入RNA测序试剂盒 | Takara | -- |
| hPSC培养与分化 | ROCK抑制剂 | R&D | 1254 |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| BMP4 | R&D | 314-BP | |
| SB | -- | -- | |
| CHIR | R&D | 4423 | |
| EDN3 | Bachem | 4095915.1000 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | 397 | |
| 流式细胞术 | 抗人CD117 (cKIT) (APC) | Invitrogen | 17-1179-42 |
| 抗CD271 (FITC) | BioLegend | 345104 | |
| 黑素母细胞扩增 | Neurobasal培养基 | gibco | 21103-049 |
| L-谷氨酰胺 | gibco | 25030-081 | |
| MEM非必需氨基酸 | gibco | 11140-050 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB/CF | |
| B27添加剂 | gibco | 12587-010 | |
| N2添加剂 | gibco | 17502-048 | |
| 黑素细胞分化 | DMEM/F12培养基 | gibco | 11330-032 |
| SCF | R&D | 255-SC-MTO | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| 青霉素/链霉素 | gibco | 15140-122 | |
| 胎牛血清 | R&D | S11150H | |
| 诱导黑色素细胞状态 | IBMX | Cayman Chemical | 13347 |
| Forskolin | EMD Millipore | 344270 | |
| qRT-PCR | Quick-RNA小量制备试剂盒 | Zymo | R1055 |
| SuperScript IV第一链合成系统 | Thermo Fisher | 18091200 | |
| Applied Biosystems PowerUp | Thermo Fisher | A25742 | |
| Seahorse Mito Stress Test | Seahorse XF线粒体压力测试 | Agilent | 103015 |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | 4707 | |
| SYTO 24 | Thermo Fisher | S7559 | |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| 脂肪酸摄取 | QBT脂肪酸摄取实验 | VWR | 10048-826 |
| BioTek Synergy酶标仪 | BioTek | -- | |
| Seahorse Fatty Acid Oxidation Test | Seahorse XF长链脂肪酸氧化压力测试试剂盒 | Agilent | 102720-100 |
| 肉碱 | Fisher Scientific | AC230280050 | |
| 油酸-BSA偶联物 | Sigma-Aldrich | O3008 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| 甘油三酯定量 | Triglyceride-Glo实验 | Promega | J3160 |
| 细胞增殖 | CyQUANT Direct Red细胞增殖实验 | Thermo Fisher | C35013 |
| Seahorse ATP rate assay | Seahorse XF实时ATP速率测试 | Agilent | 103592 |
| 脂滴染色与成像 | BODIPY FL C16 | Thermo Fisher | D3821 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 555 | Cell Signaling Technology | 44135 | |
| Alexa Fluor 488鬼笔环肽 | Thermo Fisher | A12379 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| 山羊血清 | Thermo Fisher | 50-062Z | |
| Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Zeiss LSM 880倒置共聚焦显微镜（带AiryScan） | Zeiss | -- | |
| CRISPR/Cas9敲除 | Alt-R CRISPR/Cas9系统 | Integrated DNA Technologies | -- |
| Neon转染系统 | Thermo Fisher | -- | |
| DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| Platinum SuperFi II PCR预混液 | Thermo Fisher | 12368010 | |
| Surveyor突变检测试剂盒 | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| NucleoSpin凝胶与PCR纯化试剂盒 | Takara | 740986.20 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑马鱼TEAZ黑色素瘤模型构建 | 质粒组合及浓度（MinicoopR-tdT 250 ng/µL、mitfa:Cas9 250 ng/µL、U6:sgptena 23 ng/µL、U6:sgptenb 23 ng/µL、Tol2 57 ng/µL）、注射体积1 µL、电穿孔设备 阅读提示：Methods 'Zebrafish melanoma generated by TEAZ'小节 |
| 斑马鱼dgat1a敲除实验 | U6:sgdgat1a或U6:sgNT 23 ng/µL、肿瘤面积定量方法及成像时间点（每2周） 阅读提示：Methods 'Zebrafish melanoma generated by TEAZ'及Figure 5c图注 |
| 人黑色素瘤细胞系诱导黑色素细胞状态 | IBMX 200 µM或Forskolin 20 µM处理72小时、A375细胞接种密度500,000个/孔 阅读提示：Methods 'Induction of melanocytic cell state in A375 cell line' |
| Seahorse Mito Stress Test | 细胞接种密度、oligomycin 2.0 µM、FCCP 2.0 µM、rotenone/antimycin A 0.5 µM、归一化方式（SYTO 24或BCA） 阅读提示：Methods 'Seahorse Mito Stress Test'及Figure 2b,e图注 |
| DGAT1抑制剂处理及增殖实验 | T863浓度（20 µM用于脂滴染色，1 µM和5 µM用于斑马鱼，40 µM用于ATP速率实验）、处理时长72小时、营养限制培养基配方 阅读提示：Methods 'Lipid droplet staining and imaging'、'Zebrafish blastula transplant'、'Seahorse ATP rate assay'及Figure 6d,e图注 |