BdLT-Seq技术开发与验证
建立基于附加体条形码衰减的谱系追踪方法，并验证其可行性和重现性。
构建LTv-BC-H2B-GFP和LTv-BC-mCherry附加体文库，转染HA1ER/HA1E细胞，通过FACS富集报告基因阳性细胞，在bulk和单细胞水平分析条形码衰减，结合10x scRNA-Seq构建谱系树。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于条形码衰减的BdLT-Seq方法揭示谱系相关的转录组可塑性
BdLT-Seq as a barcode decay-based method to unravel lineage-linked transcriptome plasticity.
实验完整度
高包含体外细胞模型、单细胞转录组测序、谱系追踪、多种功能验证（凋亡、细胞周期、增殖）及机制相关分析。
主要模型
HA1ER细胞（F12克隆及其亚克隆1F8、1C9） HA1E永生化细胞 表达六种突变RAS变体的HA1E混合细胞群 TRAIL耐药HA1ER细胞群
重点核对
LTv-BC-H2B-GFP或LTv-BC-mCherry附加体文库转染效率25–35%，转染后48小时分选GFP或mCherry阳性细胞，分选纯度>94% BdLT-Seq实验在转染后约5–7天开始的Phase II进行，细胞按每孔2000–3000个接种，追踪时间点包括Day 0、Day 5/Day 7和Day 14 TRAIL处理：重组人TRAIL（rhTRAIL）1 μg/ml连续处理5天以产生耐药群体，撤药3天用于追踪 流式细胞术检测cleaved PARP（Alexa 647抗体，1:200稀释）评估TRAIL诱导凋亡 单细胞RNA测序使用10x Genomics Chromium平台（版本3.1），测序深度GEx库每细胞35,000–50,000读对，GFP/mCherry库每细胞10,000–12,000读对
摘要
细胞可塑性是贯穿生物体发育和进化的众多分子与细胞事件的核心生物学过程。据推测，细胞系统倾向于平衡支撑该现象的亚稳态组织，从而维持一定程度的群体稳态，以适应不断变化的环境并维持生命。值得注意的是，尽管已积累了一些间接证据支持后一种概念框架，但对亚稳态动态以及该过程在产生非遗传克隆多样性和趋异表型输出中的生物学后果的直接观察，仍很大程度上未被探索。为填补这一空白，我们开发了一种称为条形码衰减谱系追踪测序（BdLT-Seq）的谱系追踪技术。BdLT-Seq基于附加体编码的分子标识符，借助细胞分裂时追踪信息的动态衰减，为细胞谱系树赋予方向性，同时将非遗传分子特征与可比基因组背景下的表型直接关联。我们证明，在基础生长条件下、癌基因激活后以及治疗信号可逆耐药过程中，细胞转录组状态既可被继承，又依细胞谱系内编码的受限规则动态重塑，从而调整表型输出，导致克隆内非遗传多样性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞谱系是否决定转录组状态的继承与可塑性，以及非遗传多样性如何在同基因细胞群体中产生表型输出差异。
- 核心机制
- 附加体编码的条形码随细胞分裂随机分配并衰减，为谱系树提供方向性；转录组状态沿谱系继承并受谱系限制进行非随机重塑，从而产生克隆内非遗传多样性。
- 主要证据
- 在HA1ER和HA1E细胞中结合BdLT-Seq与scRNA-Seq，追踪基础生长、RAS变体表达和TRAIL可逆耐药条件下的谱系与转录组状态，发现转录组状态继承和受限可塑性。
- 研究意义
- BdLT-Seq提供了一种在基因组不变背景下研究非遗传谱系与转录组可塑性的工具，提示非遗传成分在表型输出和群体动态中起重要作用，可能适用于肿瘤进化等复杂场景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基础生长条件下转录组状态继承与可塑性分析
探究同基因克隆群体中转录组状态是否沿谱系继承并受限分化。
对转染LTv-BC-H2B-GFP的HA1ER F12克隆进行BdLT-Seq-coupled-to-scRNA-Seq，追踪Day 0和Day 5细胞，分析转录组聚类和谱系关系，并验证HA1E细胞。
RAS变体依赖性转录组可塑性分析
评估不同RAS癌基因变体对谱系相关转录组可塑性的影响。
在HA1E细胞中表达六种突变RAS变体（HRAS-G12C、HRAS-Q61K、KRAS-G12V、KRAS-E62K、NRAS-Q61R、NRAS-Y64D），转染LTv-BC-mCherry文库，进行BdLT-Seq-coupled-to-scRNA-Seq，分析Day 0和Day 5的转录组聚类和谱系关系。
TRAIL可逆耐药过程中转录组动态分析
研究非遗传性TRAIL耐药及撤药后敏感性恢复过程中谱系相关的转录组继承与可塑性。
用rhTRAIL（1 μg/ml）处理HA1ER F12及其亚克隆1F8、1C9 5天产生耐药群体，转染LTv-BC-H2B-GFP文库，在耐药状态和撤药3天后进行BdLT-Seq-coupled-to-scRNA-Seq。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM（1 g/L葡萄糖） | Gibco | 10567014 |
| 潮霉素 | Thermo Fisher Scientific | 10687010 | |
| G418 | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Lipofectamine LTX试剂 | Invitrogen | 153385000 | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSAria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| BD LSRFortessa X-20细胞分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD InFlux细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| Cleaved PARP Alexa 647抗体 | Cell Signalling | 6987 | |
| Annexin V抗体 | Invitrogen | A35108 | |
| DAPI DNA复染 | BioTechne | 5748 | |
| TRAIL处理 | 重组人TRAIL | R&D Systems | 375-LT-010 |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics Chromium单细胞RNA测序系统版本3.1 | 10x Genomics | PN-1000269 |
| 哈希标签抗体 | BioLegend | A0251, A0252, A0253, A0254, A0255, A0256, A0257, A0258, A0259, A0260 | |
| Dynabeads MyOne Silane磁珠 | Invitrogen | 37002D | |
| xGen杂交与洗涤试剂盒 | IDT | 1080577 | |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | |
| Fragment Analyser 5200 | Agilent | M5310AA | |
| NovaSeq 6000版本1.5 | Illumina | 20013850 | |
| RNA提取与逆转录 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| 逆转录 | QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | 205311 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Invitrogen | A25742 |
| QuantStudio3实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | A28136 | |
| 质粒构建 | GBX附加体载体 | Addgene | 64123 |
| pRB322 | Promega | D1511 | |
| pGEM-T-easy | Promega | A1360 | |
| MegaX DH10B T1感受态细菌 | Invitrogen | C640003 | |
| One Shot ccdB Survival 2 T1 | Invitrogen | A10460 | |
| SURE2细菌菌株 | Agilent Technologies | 200152 | |
| Gateway LR Clonase II Plus酶 | Invitrogen | 12538120 | |
| Qiagen质粒中提试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| 慢病毒生产 | psPAX2包装载体 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G包膜载体 | Addgene | 12259 | |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | Sigma | H9268-5G |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | Invitrogen | 25300104 |
| IncuCyte S3活细胞分析仪 | Sartorius | 4647 | |
| Neubauer计数板 | Marienfeld | 0640030 | |
| 细菌培养 | SOC培养基 | Invitrogen | 15544034 |
| 电转化 | MicroPulser电穿孔仪 | Bio-Rad | 1652100 |
| 0.1厘米电击杯 | Bio-Rad | 1652089 | |
| 细胞培养 | RLT裂解缓冲液 | Qiagen | 79216 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BdLT-Seq谱系追踪 | 附加体文库转染效率（25–35%）、分选纯度（>94%）、追踪时间点（Day 0、Day 5/Day 7、Day 14）及Phase II起始时间（转染后5–7天） 阅读提示：Methods中'BdLT-Seq'小节及Supplementary Fig. 1e–g |
| 单细胞RNA测序 | 10x Chromium版本3.1、测序深度（GEx库每细胞35,000–50,000读对，GFP/mCherry库每细胞10,000–12,000读对）、测序类型（双端、双索引）及读段循环数 阅读提示：Methods中'BdLT-Seq'小节及测序参数描述 |
| TRAIL耐药模型 | rhTRAIL浓度（1 μg/ml）、处理时间（5天）、撤药时间（3天）及细胞克隆（F12、1F8、1C9） 阅读提示：Methods中'TRAIL treatment and generation of TRAIL-resistant cells'小节及Fig. 3a, b |
| RAS变体混合细胞群 | 六种RAS变体列表、慢病毒转导MOI（0.05）及追踪时间点（Day 0和Day 5） 阅读提示：Methods中'BdLT-Seq in a multiplexed cell population expressing RAS variants'小节及Fig. 2a |
| 流式细胞术检测凋亡 | cleaved PARP抗体稀释比例（1:200）、固定透化条件（冰甲醇）及流式细胞仪型号（BD LSRFortessa X-20） 阅读提示：Methods中'TRAIL treatment and generation of TRAIL-resistant cells'小节及Fig. 3b |