鉴定半乳糖凝集素-3与mTORC1信号组分的相互作用
探究细胞内半乳糖凝集素-3是否与mTORC1机器组分相互作用。
在HEK-293T细胞中表达FLAG-Gal3、FLAG-RagA或FLAG-RagC，进行免疫纯化和质谱分析；通过免疫共沉淀、免疫荧光、FPLC和GST pull-down验证相互作用。
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细胞内半乳糖凝集素-3是一种脂多糖传感器，通过激活mTORC1促进糖酵解
Intracellular galectin-3 is a lipopolysaccharide sensor that promotes glycolysis through mTORC1 activation.
实验完整度
高在HEK-293T、MEFs、HepG2细胞中进行了蛋白互作、功能验证及机制验证，并结合公共数据集分析。
主要模型
HEK-293T细胞 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） HepG2细胞 公共数据集（糖尿病、TCGA、GTEX）
重点核对
LPS处理浓度1 μg/ml，处理时间5-6小时，处理前无氨基酸/葡萄糖饥饿1小时 Torin1使用浓度250 nM，GB1107使用浓度5 μM（细胞实验）或0.5 μM（增殖实验） 半乳糖凝集素-3敲低使用shRNA或siRNA，过表达使用FLAG或HA标签的galectin-3 检测终点包括S6K1和4E-BP1磷酸化、HK2/PKM2/GLUT1表达、葡萄糖摄取和乳酸生成 Rag GTPases突变体（RagAQ66L、RagCS75N、RagAT21N、RagCQ120L）用于机制验证
摘要
碳水化合物结合蛋白半乳糖凝集素-3如何作为致糖尿病和致肿瘤因子发挥作用尚待研究。在此我们报道，细胞内半乳糖凝集素-3与溶酶体上的Rag GTPases和Ragulator相互作用。我们发现半乳糖凝集素-3感知脂多糖（LPS）以促进Rag GTPases和Ragulator的相互作用，导致mTORC1的激活。我们发现脂多糖/半乳糖凝集素-3-Rag GTPases/Ragulator-mTORC1轴调控一组基因，包括GLUT1、HK2和PKM2，这些基因关键参与葡萄糖摄取和糖酵解。事实上，半乳糖凝集素-3缺陷严重削弱LPS促进的糖酵解。重要的是，HK2的表达在糖尿病患者中显著降低。在包括肝细胞癌（HCC）在内的多种癌症中，半乳糖凝集素-3高表达，其表达水平与HK2和PKM2的表达水平正相关，与HCC患者的预后负相关。我们的研究揭示了半乳糖凝集素-3是LPS的传感器、mTORC1信号的重要调节因子以及葡萄糖代谢的关键调控因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞内半乳糖凝集素-3如何作为致糖尿病和致肿瘤因子发挥作用，其分子机制尚不明确。
- 核心机制
- 半乳糖凝集素-3感知并结合LPS，促进Rag GTPases与Ragulator在溶酶体上的相互作用，激活Rag GTPases并招募mTOR至溶酶体，从而激活mTORC1信号，上调GLUT1、HK2和PKM2表达，促进葡萄糖摄取和糖酵解。
- 主要证据
- 在HEK-293T、MEFs和HepG2细胞中通过免疫共沉淀、GST pull-down、免疫荧光、Western blot、RNA-seq和糖酵解测定验证了半乳糖凝集素-3与Rag GTPases/Ragulator的相互作用、LPS感知、mTORC1激活及糖酵解基因调控；公共数据集分析显示HK2在糖尿病肌肉中降低，半乳糖凝集素-3在HCC中高表达且与HK2/PKM2正相关、与预后负相关。
- 研究意义
- 研究揭示了半乳糖凝集素-3是LPS传感器、mTORC1信号调节因子和葡萄糖代谢关键调控因子，为糖尿病和肿瘤发生机制提供了分子见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证半乳糖凝集素-3对mTORC1活性的调控
探究半乳糖凝集素-3是否影响mTORC1信号活性。
在HEK-293T和MEFs中敲低或过表达半乳糖凝集素-3，用Torin1或GB1107处理，检测S6K1和4E-BP1磷酸化。
验证半乳糖凝集素-3感知LPS激活mTORC1
探究LPS是否通过半乳糖凝集素-3激活mTORC1。
HEK-293T和MEFs饥饿氨基酸和葡萄糖后，用LPS刺激，检测mTORC1活性；使用GB1107或Torin1抑制。
验证LPS促进半乳糖凝集素-3与Rag GTPases/Ragulator的相互作用及Rag活化
探究LPS是否增强半乳糖凝集素-3与Rag GTPases/Ragulator的相互作用并影响Rag核苷酸状态。
用生物素化LPS进行pull-down，免疫共沉淀检测半乳糖凝集素-3与RagA/RagC及p14/p18的相互作用，使用不同核苷酸状态的Rag突变体。
验证半乳糖凝集素-3通过mTORC1调控糖酵解基因表达
探究半乳糖凝集素-3是否通过mTORC1调控GLUT1、HK2、PKM2等糖酵解基因。
RNA-seq分析siGal3或Torin1处理的HEK-293T细胞，qPCR和Western blot验证基因表达，测定葡萄糖消耗和乳酸生成。
验证半乳糖凝集素-3在HCC细胞中的作用
探究半乳糖凝集素-3在HCC中是否通过mTORC1促进糖酵解和细胞增殖。
在HepG2细胞中敲低或过表达半乳糖凝集素-3，LPS刺激，检测mTORC1活性、糖酵解基因表达、葡萄糖摄取、乳酸生成、细胞增殖和克隆形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗RagA抗体 | Cell Signaling | 4357 |
| 抗RagC抗体 | Cell Signaling | 3360 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling | 2972 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling | 2983 | |
| 抗raptor抗体 | Cell Signaling | 2280 | |
| 抗4E-BP1抗体 | Cell Signaling | 9644 | |
| 抗磷酸化4E-BP1抗体 | Cell Signaling | 2855 | |
| 抗TSC2抗体 | Cell Signaling | 4308 | |
| 抗S6K1抗体 | Cell Signaling | 9202 | |
| 抗磷酸化S6K1抗体 | Cell Signaling | 9205 | |
| 抗NPRL2抗体 | Cell Signaling | 37344 | |
| 抗WDR59抗体 | Cell Signaling | 53385 | |
| 抗p18抗体 | Cell Signaling | 8975 | |
| 抗p14抗体 | Cell Signaling | 8145 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling | 2272 | |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling | 14793 | |
| 抗HK2抗体 | Cell Signaling | 2867 | |
| 抗GPI抗体 | Cell Signaling | 94068 | |
| 抗LDHA抗体 | Cell Signaling | 3582 | |
| 抗ULK1抗体 | Cell Signaling | 8054 | |
| 抗PKM1抗体 | Cell Signaling | 7067 | |
| 抗PKM2抗体 | Cell Signaling | 4053 | |
| 免疫沉淀 | 正常兔IgG | Cell Signaling | 2729 |
| 免疫荧光 | 抗mTOR抗体 | Abcam | ab32028 |
| 抗Lamp2抗体 | Abcam | ab25631 | |
| Western blot | 抗ATP6V1B2抗体 | Abcam | ab73404 |
| 抗SLC38A9抗体 | Abcam | ab81687 | |
| 抗半乳糖凝集素-3抗体 | Abcam | ab209344 | |
| 抗半乳糖凝集素-4抗体 | Abcam | ab175185 | |
| 抗半乳糖凝集素-2抗体 | Abcam | ab232703 | |
| 免疫荧光 | 抗大肠杆菌LPS抗体 | Abcam | ab35654 |
| Western blot | 抗GLUT1抗体 | Abcam | ab115730 |
| 抗PFKM抗体 | Abcam | ab204131 | |
| 抗WDR24抗体 | Proteintech | 20778-1-AP | |
| 抗SEC13抗体 | Proteintech | 15397-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | ABclonal | AC004 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | ABclonal | AS014 | |
| HRP标记山羊抗鼠IgG | ABclonal | AS003 | |
| 抗HA抗体 | Biomed | YM3146 | |
| 抗DEPDC5抗体 | LSBio | LS-C256035 | |
| LPS处理 | 大肠杆菌脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| 大肠杆菌脂多糖 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| mTOR抑制 | Torin1 | Sigma-Aldrich | 475991 |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 3×FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F3290 | |
| 蛋白A或G beads | Invitrogen | 10004D | |
| LPS pull-down | 生物素化脂多糖 | InvivoGen | tlrl-lpsbiot |
| 半乳糖凝集素-3抑制 | GB1107 | ChemeGen | C108365 |
| 细胞培养 | 无氨基酸和无葡萄糖RPMI 1640培养基 | USBiological | R9010-01 |
| 质谱分析 | Pierce银染试剂盒 | -- | -- |
| Acclaim PePmap C18反相柱 | Thermo scientific | -- | |
| Dionex ultimate 3000纳升液相系统 | Thermo scientific | -- | |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FPLC | Superose 6尺寸排阻柱 | Amersham Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor™ 488/568驴二抗 | Invitrogen | -- |
| DAPI | Sigma | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录系统 | Roche | -- | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| Roche LightCycler®480 II | Roche | -- | |
| 葡萄糖摄取和乳酸生成 | 葡萄糖摄取比色检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 乳酸比色检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LPS刺激处理 | LPS来源（E. coli O111:B4）、浓度（1 μg/ml）、处理时间（5-6小时）、饥饿条件（无氨基酸/葡萄糖1小时） 阅读提示：Methods中Transfection小节及Figure legends 2d, 3b, 3c, 4d, 4f, 5f, 6h |
| 抑制剂处理 | Torin1浓度（250 nM）、GB1107浓度（5 μM或0.5 μM）、处理时间 阅读提示：Methods中Antibodies and reagents小节及Figure legends 2c, 2f, 3b, 5f, 6h, 7a |
| 基因敲低/过表达 | siRNA/shRNA序列、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、siRNA终浓度（50 nM）、过表达质粒转染方法 阅读提示：Methods中Transfection和Lentiviral production and infection小节 |
| 免疫共沉淀 | 细胞裂解液组成（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% NP40）、抗体用量（2-3 μg）、孵育时间（12小时+2小时）、beads用量（60 μl） 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation and western blotting小节 |
| 葡萄糖摄取和乳酸生成测定 | 试剂盒品牌（Sigma-Aldrich）、细胞类型（HEK-293T或HepG2）、处理条件（LPS、GB1107、Torin1） 阅读提示：Methods中Glucose consumption and lactate production assay小节及Figure legends 5g, 6i |