Pear1缺失小鼠自发及博来霉素诱导肺纤维化表型分析
验证Pear1缺失是否加重肺纤维化及是否通过间充质细胞发挥作用
检测12月龄Pear1−/−与WT小鼠FVC及Masson染色胶原面积；博来霉素气管内雾化后检测FVC、生存曲线、胶原沉积、Pdgfra+间充质细胞比例及流式分析各细胞比例；构建Col1a2-CreERPear1f/f小鼠经他莫昔芬诱导后行博来霉素处理并检测肺功能、生存和病理
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PEAR1调控肺纤维化中活化成纤维细胞的扩增与细胞外基质沉积
PEAR1 regulates expansion of activated fibroblasts and deposition of extracellular matrix in pulmonary fibrosis.
实验完整度
高含基因敲除及条件敲除小鼠、博来霉素和胺碘酮模型、单细胞与bulk RNA-seq、免疫共沉淀及抗体治疗验证
主要模型
Pear1−/−小鼠及老年小鼠肺纤维化模型 Col1a2-CreER介导的间充质细胞特异性Pear1敲除小鼠 人Pear1基因替换小鼠（人源化小鼠） 原代小鼠肺成纤维细胞与人肺成纤维细胞HFL1
重点核对
博来霉素气管内雾化剂量1.5 µg/g或2 µg/g（体重），诱导后第21天检测肺功能和病理 Pear1−/−与WT小鼠及Col1a2-CreERPear1f/f与对照小鼠的分组与样本量（如FVC检测n=9对5等） LF2抗体经气管雾化于博来霉素诱导后第7天和第14天给药，剂量0.5 mg/kg与1 mg/kg，每周一次 阳性对照吡非尼酮300 mg/kg每日灌胃，自博来霉素前1天起共21天 体外刺激条件：TGFβ、FGF、PDGF刺激30分钟；PP1抑制剂Calyculin A处理15分钟
摘要
肺纤维化是一种慢性间质性肺疾病，导致不可逆、进行性的肺瘢痕化和呼吸衰竭。成纤维细胞的活化在肺纤维化的进展中发挥核心作用。本研究表明，成纤维细胞中的血小板内皮聚集受体1（PEAR1）可能作为肺纤维化治疗的靶点。老年小鼠中Pear1缺失可自发引起肺泡胶原蓄积。间充质细胞特异性Pear1缺失加重博来霉素诱导的肺纤维化，证实PEAR1可能通过调控间充质细胞功能来调节肺纤维化的进展。此外，对肺成纤维细胞的单细胞和整体组织RNA-seq分析显示，Pear1−/−纤维化肺中活化成纤维细胞簇扩增，且细胞外基质发育相关的标记基因富集。我们进一步表明，PEAR1与蛋白磷酸酶1结合，抑制纤维化因子诱导的细胞内信号传导和成纤维细胞活化。气管内雾化给予激活PEAR1的单克隆抗体可显著改善WT和Pear1人源化小鼠的肺纤维化，并显著提高其生存率。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 成纤维细胞中的PEAR1是否调控肺纤维化进展，以及激活PEAR1能否作为肺纤维化的治疗策略。
- 核心机制
- PEAR1与蛋白磷酸酶1（PP1，经质谱鉴定为PP1α）结合，抑制纤维化因子诱导的Smad2/3、AKT、ERK1/2、P38、JNK1/2磷酸化，从而抑制成纤维细胞活化和细胞外基质合成；Pear1缺失则解除该抑制，促进活化成纤维细胞扩增和胶原沉积。
- 主要证据
- 老年Pear1−/−小鼠自发肺泡胶原蓄积；间充质细胞特异性Pear1缺失加重博来霉素诱导的肺纤维化；单细胞和bulk RNA-seq显示活化成纤维细胞簇扩增及ECM/EMT基因富集；免疫共沉淀显示PEAR1与PP1结合；激活PEAR1的单克隆抗体LF1/LF2减轻博来霉素及胺碘酮诱导的肺纤维化并提高生存率。
- 研究意义
- 作者提出PEAR1是肺纤维化的潜在治疗靶点，气管内雾化给予激活PEAR1的单克隆抗体可能是肺纤维化乃至呼吸系统疾病的有效治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA-seq解析肺间充质细胞组成
明确Pear1缺失对博来霉素诱导肺纤维化中间充质细胞簇组成的影响
流式分选CD31−CD45−CD326−间充质细胞进行10x Genomics单细胞RNA-seq，整合四组条件共17934个细胞进行UMAP聚类、细胞类型注释及簇比例分析，并对活化成纤维细胞簇行GSEA、GO和KEGG富集分析
Pdgfra+细胞bulk RNA-seq及差异表达分析
在整体组织水平验证Pear1缺失纤维化肺中的基因表达和通路改变
流式分选Pdgfra+细胞行RNA-seq，进行PCA、差异基因鉴定（fold change>2且FDR<0.05）、GO和GSEA分析，并用qPCR验证EMT前缘基因，再将EMT基因映射至单细胞数据
PEAR1调控成纤维细胞信号通路及与PP1结合的机制验证
验证PEAR1对纤维化因子诱导信号通路的抑制作用及其与PP1的结合
WT与Pear1−/−小鼠肺成纤维细胞分别经TGFβ、FGF、PDGF刺激后Western blot检测Smad2/3、AKT、ERK1/2、P38、JNK1/2磷酸化；免疫共沉淀结合质谱鉴定PEAR1结合蛋白；PP1抑制剂Calyculin A处理成纤维细胞检测磷酸化及ECM基因mRNA
靶向PEAR1单克隆抗体的体内治疗评价
评估激活PEAR1的单克隆抗体对肺纤维化的治疗效果
制备抗小鼠PEAR1的LF1及抗人PEAR1的LF2抗体；在博来霉素诱导的人Pear1转基因小鼠中经气管雾化给予LF2，设吡非尼酮阳性对照和生理盐水对照，检测生存率、FVC、Masson染色胶原面积及Pdgfra/胶原IV免疫荧光；并在胺碘酮诱导模型中验证
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 博来霉素诱导肺纤维化模型 | 博来霉素 | Selleck Chemicals | S1214 |
| 胺碘酮诱导肺纤维化模型 | 胺碘酮 | Sigma | A8423 |
| 抗体治疗对照 | 免疫球蛋白G | Biolgend | 401411 |
| 原代肺成纤维细胞分离 | I型胶原酶 | Sigma | C0130 |
| IV型胶原酶 | Gibico | 17104-019 | |
| 透明质酸酶 | Sigma | H4272 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Sigma | DN25 | |
| 原代肺成纤维细胞培养 | I型胶原 | Corning | 354236 |
| 流式分析 | PerCP-Cy5.5大鼠抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 561869 |
| PE/Cy7抗小鼠CD31抗体 | Biolegend | 102418 | |
| BV421大鼠抗小鼠CD326抗体 | BD Biosciences | 563214 | |
| PE抗小鼠Pdgfra抗体 | Thermo Fisher | 12-1401-81 | |
| APC抗人PEAR1抗体 | R&D Systems | FAB4527R | |
| Masson染色 | 丽春红2R | Sangon | A600753 |
| 酸性品红 | Sangon | A610469 | |
| 磷钼酸 | Sangon | A600709 | |
| 亮绿 | Sangon | A6110007 | |
| 质粒转染 | 聚乙烯亚胺 | Polyscience | 24765 |
| 免疫共沉淀 | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013J |
| 蛋白酶抑制剂 | Bimake | 14001 | |
| 抗PP1抗体 | Santa Cruze | SC7482 | |
| 小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 5415 | |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruze | SC2003 | |
| 成纤维细胞刺激 | 转化生长因子β | R&D Systems | 7666-MB |
| 成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | 3139-FB | |
| 血小板衍生生长因子 | R&D Systems | 1447-PC | |
| PP1抑制处理 | 花萼海绵诱癌素A | Abcam | 141784 |
| Western blot | 抗磷酸化Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8828 |
| 抗磷酸化P38抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗GAPDH抗体 | Yeasen | 30201ES | |
| 抗兔IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 血小板聚集实验 | 胶原 | Chrono-log | P/N385 |
| 凝血酶 | Enzyme Research Laboratories | HT4082A | |
| 血小板流式分析 | FITC标记抗小鼠P-选择素抗体 | BD Biosciences | 553744 |
| JON/A(PE)抗体 | Emfret Analytics | M023-2 | |
| 管腔形成实验 | BD Matrigel基底膜基质 | BD Biosciences | -- |
| 细胞解离液 | Yeasen | -- | |
| 单细胞RNA-seq | 10x Genomics单细胞3' v3 RNA测序试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| bulk RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| SMART-Seq v4超低起始量RNA试剂盒 | Clontech Laboratories, Inc. | -- | |
| TruePrep DNA文库构建试剂盒V2 | Vazyme | TD502 | |
| 人肺成纤维细胞刺激 | 人转化生长因子β | R&D Systems | 240-B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 博来霉素诱导肺纤维化模型 | 博来霉素剂量1.5 µg/g或2 µg/g（体重）、气管内雾化方式、诱导后第21天检测终点 阅读提示：Methods“Bleomycin-induced mouse PF model”及Fig. 1图注 |
| Pear1基因敲除与条件敲除小鼠构建 | 敲除策略（exon 6-7插入cassette）、Col1a2-CreER他莫昔芬诱导方案（90 mg/kg每日一次共7次）、小鼠周龄与性别 阅读提示：Methods“Construction of mice”及Supplementary Fig. 1a、2a |
| 单细胞RNA-seq | 每组5只小鼠混合、CD31−CD45−CD326−分选策略、质控标准（线粒体基因>10%去除、nFeature_RNA阈值）、聚类参数 阅读提示：Methods“Single-cell RNA sequencing”及“scRNA-seq raw data processing”小节 |
| PEAR1与PP1结合及信号通路验证 | TGFβ/FGF/PDGF刺激30分钟、Calyculin A浓度1/10/100 nM处理15分钟、Western blot重复三次 阅读提示：Methods“Detection of relevant protein expression by western blot”及Fig. 3图注 |
| LF2抗体体内治疗 | LF2剂量0.5 mg/kg与1 mg/kg、第7天和第14天经气管雾化、每周一次、吡非尼酮300 mg/kg每日灌胃、各组样本量 阅读提示：Methods“Bleomycin-induced mouse PF model”及Fig. 4b–f图注 |
| 胺碘酮诱导肺纤维化模型 | 胺碘酮剂量0.4 μg/g或0.8 μg/g（体重）、每5天雾化一次、第23天检测、抗体给药时间 阅读提示：Methods“Amiodarone-induced mouse PF model”及Supplementary Fig. 11e、f |