筛选抑制NF-κB活化的分泌蛋白
鉴定胞内金黄色葡萄球菌分泌的具有抗炎作用的效应蛋白
在HEK293T细胞中利用双荧光素酶报告基因实验检测78种金黄色葡萄球菌成熟分泌蛋白对TNF-α诱导的NF-κB活化的影响，发现Efb可抑制NF-κB活化
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胞内金黄色葡萄球菌释放的细胞外纤维蛋白原结合蛋白通过靶向TRAF3抑制宿主免疫
Extracellular fibrinogen-binding protein released by intracellular Staphylococcus aureus suppresses host immunity by targeting TRAF3.
实验完整度
高含体外细胞模型、基因敲除小鼠感染模型及机制验证（泛素化、共免疫沉淀、GST pull-down）
主要模型
HEK293T细胞 MH-S肺泡巨噬细胞 小鼠腹腔巨噬细胞（PMs） C57BL/6小鼠气管插管感染模型
重点核对
S. aureus Newman、ΔEfb、ΔEfb+Flag-Efb及ΔEfb+Flag-Efb K71R菌株的构建与鉴定 巨噬细胞感染MOI=25，感染时间点（如4 h、6 h） 小鼠气管内给药2×10^8 CFUs，感染24 h后检测肺组织细胞因子和细菌载量 TRAF3^flox/flox与TRAF3^flox/flox,Lyz2-Cre小鼠的基因型鉴定 Efb K71R突变对K27泛素化及TRAF3 K48泛素化的影响
摘要
许多病原体分泌效应蛋白劫持宿主免疫细胞内的信号调节因子以促进致病。然而，金黄色葡萄球菌分泌效应蛋白在宿主细胞内的致病机制尚不清楚。在此，我们报道金黄色葡萄球菌将细胞外纤维蛋白原结合蛋白（Efb）分泌到巨噬细胞胞质中以抑制宿主免疫。机制上，宿主E3连接酶RING finger protein 114介导Efb第71位赖氨酸的K27连接泛素化，从而促进肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）的招募。Efb与TRAF3的结合破坏了TRAF3/TRAF2/cIAP1（细胞凋亡抑制因子1）复合物的形成，该复合物介导TRAF3的K48泛素化以促进其降解，从而抑制炎症信号级联。此外，Efb K71R突变体丧失了抑制炎症的能力并表现出致病性降低。因此，我们的发现揭示了金黄色葡萄球菌抑制宿主防御的一种此前未知的机制，该机制可能成为开发有效抗金黄色葡萄球菌免疫调节剂的有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胞内金黄色葡萄球菌分泌的效应蛋白Efb如何调控巨噬细胞炎症信号通路及其致病机制。
- 核心机制
- 宿主E3连接酶RNF114介导Efb第71位赖氨酸K27连接泛素化，促进Efb与TRAF3结合，破坏TRAF3/TRAF2/cIAP1复合物，抑制TRAF3第155位赖氨酸K48泛素化降解，从而抑制NF-κB和MAPK炎症信号。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞、MH-S细胞和PMs中通过共免疫沉淀、泛素化实验和qPCR验证；在C57BL/6小鼠气管感染模型中检测肺组织细胞因子、细菌载量和病理变化；TRAF3条件敲除小鼠中Efb的抑制效应消失。
- 研究意义
- 揭示了金黄色葡萄球菌抑制宿主免疫的一种此前未知的机制，Efb-RNF114界面可能成为开发有效抗金黄色葡萄球菌治疗手段的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Efb对巨噬细胞炎症反应的抑制作用
验证胞内表达的Efb对巨噬细胞炎症因子表达和信号通路的影响
腺病毒介导Efb在腹腔巨噬细胞中过表达，热灭活金黄色葡萄球菌刺激后检测p65磷酸化和Tnf、Il1β、Il6、Il12p40 mRNA水平；构建ΔEfb及回补菌株感染MH-S细胞，检测炎症因子mRNA和蛋白水平
建立小鼠感染模型评估Efb的体内致病作用
在体内验证Efb对宿主炎症反应和细菌载量的影响
6周龄C57BL/6小鼠经气管内接种Newman、ΔEfb或ΔEfb+Flag-Efb菌株，24 h后检测肺组织细胞因子水平、细菌载量和病理变化；另用致死性肺炎、菌血症和皮肤感染模型评估生存率和皮肤病变
鉴定Efb与TRAF3的相互作用
确定Efb在宿主细胞内的直接结合靶点
通过免疫电镜和免疫荧光观察Efb在巨噬细胞胞质中的分泌和累积；利用共免疫沉淀从TLR通路关键分子中筛选Efb结合蛋白，鉴定出TRAF3；通过GST pull-down验证直接相互作用；利用TRAF3截短体确定锌指结构域介导结合
验证TRAF3在Efb抑制炎症中的介导作用
明确TRAF3对Efb抗炎功能的必要性
利用TRAF3^flox/flox,Lyz2-Cre条件敲除小鼠分离PMs，感染Newman或ΔEfb菌株，检测炎症因子mRNA；在TRAF3条件敲除小鼠中感染并检测肺组织细胞因子、细菌载量和病理变化；使用NIK SMI1、GSK8612、5Z-7-oxozeaeno抑制特定通路验证下游信号
解析Efb调控TRAF3稳定性的分子机制
阐明Efb如何影响TRAF3的泛素化修饰和降解
检测Newman与ΔEfb感染后巨噬细胞中TRAF3蛋白水平；通过泛素化实验检测TRAF3的K48和K63泛素化；共免疫沉淀检测TRAF3与TRAF2、cIAP1的相互作用；利用TRAF3 K/R突变体确定K48泛素化位点；体外泛素化反应验证Efb对TRAF3 K48泛素链的抑制
鉴定Efb的泛素化修饰及修饰酶
确定Efb在宿主细胞内的泛素化类型、修饰位点和关键E3连接酶
将Efb与不同泛素突变体共转染HEK293T细胞，发现K27连接泛素化占主导；在感染巨噬细胞中检测内源性Efb的K27泛素化；通过质谱鉴定RNF114为候选E3连接酶；验证RNF114与Efb的相互作用及对Efb K27泛素化的促进作用；构建20个Efb赖氨酸突变体确定K71为主要修饰位点
验证Efb K27泛素化对其抑制TRAF3信号和致病性的影响
明确Efb K27泛素化在稳定TRAF3和抑制炎症中的功能重要性
比较野生型Efb和K71R突变体对TRAF3 K48泛素化、TRAF3/TRAF2/cIAP1复合物形成的影响；在ΔEfb回补野生型Efb或K71R突变体的巨噬细胞和小鼠中检测炎症因子、细菌载量和病理变化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白酶大豆肉汤 | OXOID | CM0129B |
| 卡那霉素 | Sanggon Biotech | -- | |
| 氯霉素 | Sanggon Biotech | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| RPMI-1640培养基 | HyClone | -- | |
| 中性粒细胞分离 | 抗Ly6G微珠 | Miltenyi | 130-120-337 |
| Western blot | 兔抗TRAF3抗体 | Invitrogen | PA5-20165 |
| 兔抗TRAF3抗体 | Abcam | ab36988 | |
| 鼠抗TRAF3抗体 | Santa Cruz | sc6933 | |
| 兔抗TRAF2抗体 | Cell signaling technology, CST | 4724 | |
| 鼠抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 兔抗HA抗体 | CST | 3724 | |
| 兔抗Myc抗体 | CST | 2040 | |
| 兔抗磷酸化p65抗体 | CST | 3033 | |
| 兔抗磷酸化p38抗体 | CST | 9215 | |
| 兔抗磷酸化Erk1/2抗体 | CST | 9101 | |
| 兔抗磷酸化JNK抗体 | CST | 4668 | |
| 兔抗GFP抗体 | CST | 2956 | |
| 兔抗K27抗体 | Abcam | ab181537 | |
| 兔抗K48抗体 | CST | 8081 | |
| 兔抗K63抗体 | CST | 5621 | |
| 兔抗cIAP1抗体 | Abcam | ab2399 | |
| 兔抗RNF114抗体 | Abcam | ab97303 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor Plus 488标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A32723 |
| Alexa Fluor Plus 555标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A32727 | |
| Alexa Fluor Plus 647标记山羊抗兔IgG | Invitrogen | A32733 | |
| Western blot | 兔抗GST抗体 | Cwbio | CW0085M |
| 兔抗His抗体 | Cwbio | CW0083M | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Sigma-Aldrich | G9545 | |
| 免疫沉淀 | 鼠抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 鼠抗HA磁珠 | Thermo Fisher | 88836 | |
| 鼠抗TRAF3琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc6933 AC | |
| Western blot | 山羊抗兔IgG | CST | 5127 |
| 山羊抗小鼠IgG | CST | 96714 | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Sangon Biotech | E607303 |
| 流式细胞术 | 大鼠抗小鼠Ly6G PE | BD | 551461 |
| 大鼠抗小鼠CD11b-FITC | BD | 557396 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-2 |
| jetMSSENGER转染试剂 | Polyplus | 150-07 | |
| INVI DNA RNA转染试剂 | Invigentech | IV1216100 | |
| 免疫电镜 | 免疫电镜固定液 | Wanwu | G1124 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 肿瘤坏死因子α | R&D | 210-TA |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Beyotime | RG028 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693116001 |
| Western blot | ECL试剂 | Thermo Fisher | 32209 |
| ECL试剂 | Thermo Fisher | 34095 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara | 9109 |
| 逆转录 | PrimeScript™逆转录试剂盒 | Takara | RR037 |
| qPCR | SYBR RT-PCR试剂盒 | Toyobo | QPK-212 |
| 细菌培养 | 胰蛋白酶大豆琼脂平板 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌感染与巨噬细胞刺激 | MOI=25；感染时间点（如4 h、6 h）；所使用的菌株（Newman、ΔEfb、ΔEfb+Flag-Efb、ΔEfb+Flag-Efb K71R） 阅读提示：Methods“Bacterial strains and cells”及Figure legends；Supplementary Table 1 |
| 小鼠气管感染模型 | 小鼠品系（C57BL/6，6周龄雌性）；给药剂量2×10^8 CFUs（或6×10^8 CFUs用于致死模型）；感染时间24 h；样本量n=9（细胞因子）或n=5（病理） 阅读提示：Methods“Mice infection model”及Figure 1、3、6 legends |
| TRAF3条件敲除小鼠实验 | 基因型TRAF3^flox/flox与TRAF3^flox/flox,Lyz2-Cre；PMs分离方法（硫代乙醇酸盐诱导）；感染条件MOI=25 阅读提示：Methods“Mice infection model”及Figure 3 legend |
| Efb泛素化位点鉴定 | Efb K71R突变体构建；RNF114过表达或siRNA敲低；K27泛素化检测 阅读提示：Results“RNF114 mediated K27-linked ubiquitination of Efb”及Figure 5 legend |
| TRAF3 K48泛素化检测 | TRAF3 K/R、R106K、R155K、R106/155K突变体；体外泛素化反应体系组成（E1、E2、Flag-TRAF2、Flag-cIAP1、 ubiquitin、Mg-ATP） 阅读提示：Methods“Ubiquitination assay”及Figure 4 legend |