PDX模型建立与ribociclib药效筛选
评估ribociclib在ER+和HER2+乳腺癌PDX中的抗肿瘤活性并确定耐药模型。
将患者肿瘤样本植入免疫缺陷小鼠建立PDX，扩增后随机分组给予ribociclib 75 mg/kg或溶剂对照，测量肿瘤体积变化并按mRECIST分类。
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高p16表达与RB1杂合性缺失是ER+乳腺癌中CDK4/6抑制剂耐药的生物标志物
High p16 expression and heterozygous RB1 loss are biomarkers for CDK4/6 inhibitor resistance in ER+ breast cancer.
实验完整度
高包含37例PDX体内药效、PDC离体培养、细胞系过表达、患者样本IHC及基因组数据分析等多层级证据，并开展功能与机制验证。
主要模型
37例乳腺癌患者来源异种移植瘤（PDX）模型 患者来源肿瘤细胞（PDC）短期3D离体培养 ER+乳腺癌细胞系T47D和MCF7（含p16或cyclin D1过表达） ER+乳腺癌患者肿瘤样本（ABC-POP试验及转移性队列）
重点核对
PDX体内药效：ribociclib 75 mg/kg口服灌胃，每日一次，每周6天；alpelisib 35 mg/kg；联合给药间隔1小时；肿瘤体积变化按mRECIST分类。 PDC离体药效：ribociclib 1 µM处理7天，检测球体面积变化和EdU掺入； cut-off为球体面积变化−25%。 细胞系IC50：T47D和MCF7细胞接种2×10^3/孔，处理6天，结晶紫染色测定IC50；p16过表达需1 µg/ml多西环素诱导48小时。 患者样本生物标志物：IHC检测p16、pRb、cyclin E1、cyclin D1；p16高定义≥2，pRb低≤2，cyclin E1/D1高>4/6。 PDX模型来源与维持：6周龄雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ或HsdCpb:NMRI-Foxn1nu小鼠，饮水补充1 µmol/L 17β-estradiol。
摘要
CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗在晚期雌激素受体阳性乳腺癌治疗中显示出比单独内分泌治疗更高的抗肿瘤活性。其中一些肿瘤对CDK4/6抑制剂存在原发耐药，另一些则产生获得性耐药。在此，我们显示p16过表达与患者来源异种移植瘤（n=37）和雌激素受体阳性乳腺癌细胞系中CDK4/6抑制剂抗肿瘤活性降低相关，也与早期和晚期乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂反应降低相关（n=89）。我们还发现RB1杂合性缺失是获得性耐药和临床结局不良的生物标志物。CDK4/6抑制剂ribociclib与PI3K抑制剂alpelisib联合在雌激素受体阳性非基底样乳腺癌患者来源异种移植瘤中显示出抗肿瘤活性，且不依赖于PIK3CA、ESR1或RB1突变状态，在药物降阶梯实验或省略内分泌治疗时也是如此。我们的结果为预测CDK4/6抑制剂的原发/获得性耐药及进展后治疗策略提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 识别ER+乳腺癌中对CDK4/6抑制剂原发性和获得性耐药的生物标志物，并探索耐药后的治疗策略。
- 核心机制
- p16过表达通过激活G1检查点激酶活性减弱对CDK4/6抑制剂的反应；RB1杂合性缺失的肿瘤可获得RB1第二击突变（双等位基因失活）导致获得性耐药；PI3K抑制剂alpelisib可增敏非基底样耐药肿瘤。
- 主要证据
- 在37例PDX中，p16高表达与ribociclib耐药相关（p=0.01），复合生物标志物（p16、pRb、cyclin E1、cyclin D1）预测耐药的敏感性87%、准确性85%；PDC离体验证显示一致反应；细胞系过表达p16使ribociclib IC50升高17-20倍；患者样本中p16高与abemaciclib反应降低相关（p=0.008）；RB1双打击与既往CDK4/6抑制剂暴露相关（p=0.003）；ribociclib联合alpelisib在耐药PDX中显示抗肿瘤活性。
- 研究意义
- 为预测CDK4/6抑制剂的原发性和获得性耐药提供了生物标志物，并提示CDK4/6抑制剂联合PI3K抑制剂可作为非基底样肿瘤进展后的治疗策略，不依赖于PIK3CA、ESR1或RB1状态。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
耐药生物标志物的鉴定与验证
通过遗传、转录组和蛋白水平分析识别与ribociclib耐药相关的生物标志物。
对PDX进行PAM50分型、MSK-IMPACT靶向测序、RT-qPCR和IHC检测p16、pRb、cyclin E1、cyclin D1等蛋白表达，分析其与药效反应的相关性。
PDC离体培养验证生物标志物
在短期3D离体培养中验证p16、pRb、cyclin E1、cyclin D1复合生物标志物对ribociclib反应的预测价值。
从PDX分离肿瘤细胞，在Matrigel上培养，给予ribociclib 1 µM处理7天，检测球体面积变化和EdU掺入。
细胞系过表达p16或cyclin D1的功能验证
验证p16或cyclin D1过表达是否直接减弱ER+乳腺癌细胞对ribociclib的反应。
在T47D和MCF7细胞中通过慢病毒转染建立多西环素诱导的p16过表达或cyclin D1过表达细胞，测定ribociclib、fulvestrant及其联合的IC50，并进行竞争实验和免疫印迹分析。
患者样本中生物标志物的临床关联分析
分析p16、pRb、cyclin E1、cyclin D1表达与ER+乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂反应的关系。
对ABC-POP试验的72例早期乳腺癌患者和10例转移性乳腺癌患者的肿瘤样本进行IHC检测，分析生物标志物与KI67反应或临床获益的关联。
获得性耐药机制研究：RB1杂合性缺失与第二击
探究RB1杂合性缺失的肿瘤是否通过获得RB1第二击突变产生对ribociclib的获得性耐药。
从PDX244衍生的ribociclib耐药肿瘤进行拷贝数和突变分析，检测RB1、CDKN2A、CCNE1、CCND1状态及pRb蛋白表达；分析PDX476配对样本和HMF队列数据。
PI3K抑制剂联合CDK4/6抑制剂的体内药效评估
评估alpelisib联合ribociclib在ribociclib耐药PDX中的抗肿瘤活性，并探索降阶梯策略。
在23例PDX中比较ribociclib单药、alpelisib单药及联合的肿瘤生长抑制效果；在耐药模型中进行剂量降低实验和联合fulvestrant的三联实验；检测KI67和磷酸化pRb。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | cyclin D1抗体 | ThermoScientific | RM9104 |
| pRb抗体 | BD Pharmigen | 554136 | |
| 磷酸化pRb S807/811抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| cyclin E1抗体 | Millipore | 05-363 | |
| p16抗体 | Ventana Medical Systems, Roche | 725-4713 | |
| ER抗体 | Ventana Medical Systems, Roche | 790-4324 | |
| PR抗体 | Ventana Medical Systems, Roche | 790-2223 | |
| Ki67抗体 | Ventana Medical Systems, Roche | 790-4286 | |
| HER2抗体 | Ventana Medical Systems, Roche | 790-2991 | |
| 免疫荧光 | 细胞角蛋白18抗体 | Abcam | ab133263 |
| Alexa Fluor® 568抗波形蛋白抗体 | Abcam | ab202504 | |
| Alexa Fluor® 488山羊抗兔IgG | -- | A48282 | |
| Western blot | CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 |
| cyclin D2抗体 | Cell Signaling Technology | 3741 | |
| 磷酸化pRb S807/811抗体 | Cell Signaling Technology | 9308 | |
| 磷酸化pRb S780抗体 | Cell Signaling Technology | 9307 | |
| 磷酸化CDK2 T160抗体 | Cell Signaling Technology | 2561 | |
| 磷酸化AKT T308抗体 | Cell Signaling Technology | 2965 | |
| 磷酸化AKT S473抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| FGFR1抗体 | Cell Signaling Technology | 3472 | |
| CDK6抗体 | Abcam | ab124821 | |
| cyclin D1抗体 | Abcam | ab40754 | |
| cyclin E2抗体 | Abcam | ab40890 | |
| Tubulin抗体 | Sigma | T-9026 | |
| cyclin E1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-481 | |
| CDK2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-163 | |
| 人GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc137179 | |
| p16-INKA抗体 | ProteinTech | 10883-I-AP | |
| ER-alpha抗体 | Neomarkers | MS-315-P0 | |
| 山羊抗兔IgG HRP标记全抗体 | Sigma-Aldrich | NA934 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP标记全抗体 | Sigma-Aldrich | NA931 | |
| 药物处理 | Ribociclib | Novartis | LEE11 |
| Alpelisib | Novartis | BYL719 | |
| Fulvestrant | Selleckchem | -- | |
| Letrozole | Selleckchem | -- | |
| P18IN003 | Glixxlabs | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640 with GlutaMAX培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PDC培养 | MEGM乳腺上皮细胞生长培养基套装 | LONZA | -- |
| Corning® Matrigel®生长因子减少型基底膜基质 | Corning, INC | -- | |
| EdU检测 | Click-iT™ EdU Alexa Fluor™ 488成像试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 免疫印迹 | Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- |
| 慢病毒感染 | pLX401-INK4A载体 | Addgene | 121919 |
| 人cyclin D1 mGFP标记慢病毒ORF克隆 | Origene | RC204957L2 | |
| Lenti-C-mGFP标记空载体 | Origene | PS100071 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDX体内药效实验 | ribociclib剂量75 mg/kg、口服灌胃每日一次每周6天；alpelisib 35 mg/kg同 schedule；联合给药间隔1小时；fulvestrant 10 mg/小鼠皮下每周两次；letrozole 20 mg/kg口服每周三次；trastuzumab 10 mg/kg腹腔每周两次；肿瘤体积100–300 mm3随机分组；第35天评估。 阅读提示：Methods中In vivo experiments小节及图1、图7图注。 |
| PDC离体药效实验 | PDC接种密度2×10^5 cells/ml于Matrigel；ribociclib 1 µM处理7天；球体面积变化cut-off −25%；EdU 10 µM孵育2天；至少三个生物学重复。 阅读提示：Methods中PDC ex vivo cultures和Analysis of PDCs area小节及图3图注。 |
| 细胞系IC50测定 | 细胞接种2×10^3/孔；处理6天；p16过表达需1 µg/ml多西环素诱导48小时；ribociclib浓度0.5、1、1.5 µM用于生化分析；结晶紫染色560 nm读数。 阅读提示：Methods中In vitro cell line assessment小节及图4图注。 |
| 患者样本IHC生物标志物分析 | p16高≥2，pRb低≤2，cyclin E1/D1高>4/6；ABC-POP试验abemaciclib 150 mg每日两次治疗14天；敏感定义为第15天KI67自然对数<1；转移性队列敏感定义为临床获益≥6个月和/或≥10周期。 阅读提示：Methods中Study design和Immunohistochemistry小节及图5图注。 |
| RB1杂合性缺失与获得性耐药分析 | PDX244衍生耐药肿瘤的拷贝数阈值：Deep-Del CN<−1，Shallow-Del −1≤CN<−0.4，Unaltered CN≥−0.4；HMF队列n=582，其中71例接受CDK4/6i；RB1双打击定义：同时存在突变和杂合性缺失。 阅读提示：Methods中Statistical analysis小节及图6图注。 |