鉴定TEAD4相互作用蛋白
寻找CRC中TEAD4的新转录共调控因子。
在稳定表达FLAG-TEAD4的HCT-116细胞中进行免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS/MS）分析，鉴定TEAD4结合蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CK2诱导的HHEX与YAP-TEAD4复合物的协同作用促进结直肠癌发生
CK2-induced cooperation of HHEX with the YAP-TEAD4 complex promotes colorectal tumorigenesis.
实验完整度
高包含细胞系、小鼠异种移植、AOM/DSS模型、类器官、患者样本等多层级证据，并有功能与机制验证。
主要模型
HCT-116和SW-480结直肠癌细胞系 HEK-293T细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 Villin-Hhexf/f小鼠AOM/DSS诱导结直肠癌模型 患者来源类器官（PDO）
重点核对
HCT-116细胞中HHEX敲低或过表达对YAP/TAZ靶基因mRNA水平的影响 裸鼠皮下注射1×10^6个HCT-116细胞后的肿瘤生长和重量（n=6） CX-4945（10 μM）和维替泊芬（2 μM）单用或联用48小时对CRC细胞活力和PARP1剪切的影响 AOM/DSS模型中Hhex敲除对结肠肿瘤数量的影响 患者来源类器官中CX-4945和维替泊芬联用的相对活力
摘要
Hippo通路的失调导致包括结直肠癌（CRC）在内的多种癌症中YAP-TEAD转录复合物的过度激活。在本研究中，我们观察到HHEX（造血表达同源盒）可能增强YAP-TEAD复合物的转录活性。HHEX与YAP-TEAD复合物结合并使其在调控基因组位点上稳定，从而共同调控一组YAP/TEAD靶基因的表达。此外，HHEX可能通过控制YAP/TAZ表达间接调控这些靶基因。重要的是，HHEX是YAP在CRC进展中促肿瘤效应所必需的。在血清刺激下，CK2（酪蛋白激酶2）磷酸化HHEX并增强其与TEAD4的相互作用。CK2抑制剂CX-4945减弱HHEX与TEAD4之间的相互作用，导致YAP/TEAD靶基因表达降低。CX-4945与YAP-TEAD抑制剂维替泊芬和Super-TDU的抗肿瘤活性协同作用。HHEX表达升高与YAP/TEAD过度激活相关，并与CRC患者的不良预后相关。总之，我们的研究确定HHEX是YAP/TEAD的正向调节因子，促进结直肠癌发生，为靶向CRC中的YAP/TEAD提供了新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HHEX是否以及如何调控YAP-TEAD复合物的转录活性，从而影响结直肠癌发生？
- 核心机制
- CK2磷酸化HHEX，增强HHEX与TEAD4的相互作用；HHEX通过不同结构域分别结合YAP和TEAD4，稳定YAP-TEAD复合物在靶基因调控位点上，促进YAP/TEAD靶基因转录。
- 主要证据
- 在HCT-116和SW-480细胞中，HHEX敲低降低YAP/TEAD靶基因表达和细胞增殖；在裸鼠异种移植模型中，HHEX敲低抑制肿瘤生长；在AOM/DSS模型中，Hhex敲除减少结肠肿瘤数量；ChIP-seq和ChIP-qPCR显示HHEX与TEAD4共占靶基因位点；CK2抑制剂CX-4945减弱HHEX-TEAD4相互作用并降低靶基因表达。
- 研究意义
- 研究提出HHEX是YAP/TEAD的正向调节因子，促进结直肠癌发生，为靶向YAP/TEAD提供了新的治疗策略；CK2抑制剂与YAP-TEAD抑制剂联用可协同抑制CRC生长。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HHEX与YAP-TEAD复合物的相互作用
确认HHEX与TEAD4、YAP/TAZ的物理相互作用及其对YAP-TEAD复合物稳定性的影响。
在HEK-293T和HCT-116细胞中进行co-IP、内源性co-IP、邻近连接实验（PLA）和免疫荧光共定位；使用DNase处理验证DNA非依赖性；构建HHEX和TEAD4突变体定位相互作用结构域。
检测HHEX对YAP/TEAD转录活性的调控
确定HHEX是否促进YAP-TEAD复合物的转录活性及其靶基因表达。
TEAD荧光素酶报告基因实验；RNA-seq分析HHEX、YAP/TAZ、TEAD1/2/3/4敲低后的差异基因；qPCR检测YAP/TEAD经典靶基因（CTGF、CYR61、AXL、ANKRD1、LATS2）mRNA水平。
全基因组定位HHEX与TEAD4的结合位点
确定HHEX与TEAD4在基因组上的共占位及其对靶基因的直接调控。
HCT-116细胞HHEX ChIP-seq；利用ENCODE TEAD4 ChIP-seq数据集；ChIP-qPCR验证HHEX在CTGF、CYR61、ANKRD1位点的结合及TEAD1/3/4敲低对结合的影响。
验证HHEX对CRC细胞增殖和肿瘤生长的作用
确定HHEX在体外和体内对CRC细胞增殖和肿瘤生长的作用。
CCK-8和克隆形成实验检测HHEX敲低或过表达对HCT-116和SW-480细胞增殖的影响；裸鼠皮下异种移植实验检测肿瘤生长；Ki67免疫组化染色。
评估HHEX敲除对AOM/DSS诱导结直肠癌的影响
在体内验证HHEX对结直肠癌发生的促进作用。
构建Villin-Hhexf/f小鼠，通过AOM/DSS诱导结直肠癌模型；检测肠道组织中Hippo靶基因mRNA水平、Ki67阳性细胞、类器官生长和肿瘤数量。
研究CK2对HHEX-TEAD4相互作用的调控
确定CK2是否磷酸化HHEX并增强其与TEAD4的相互作用。
过表达CK2α+β或激酶失活突变体CK2αK68M+β；敲低CK2或使用CX-4945；血清刺激实验；构建HHEX S163/177E（磷酸模拟）和S163/177C（磷酸缺陷）突变体；检测相互作用、TEAD荧光素酶活性、靶基因表达和ChIP-qPCR。
评估CX-4945与维替泊芬联合抗肿瘤效果
测试CK2抑制剂和YAP-TEAD抑制剂联用是否协同抑制CRC生长。
CCK-8和克隆形成实验检测细胞活力；Western blot检测PARP1剪切；HCT-116异种移植模型评估肿瘤生长；免疫组化检测Ki67和cleaved PARP1；患者来源类器官（PDO）活力检测。
分析HHEX在CRC临床样本中的表达及预后意义
评估HHEX表达与CRC临床特征和预后的相关性。
qPCR和Western blot检测CRC组织与配对正常组织中HHEX表达；免疫组化分析172对CRC和正常组织芯片；Kaplan-Meier生存分析；TCGA数据集分析HHEX与YAP靶基因特征的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
验证转录活性与基因表达
验证基因组结合
评估类器官活力
蛋白质表达检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 质粒构建 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| 突变体构建 | KOD突变试剂盒 | Toyobo | -- |
| 瞬时转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
| Lipofectamine RNAi MAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 病毒转导 | 聚brene | -- | -- |
| 药物处理 | CX-4945 | Selleck Chemicals | -- |
| Super-TDU | Selleck Chemicals | -- | |
| 维替泊芬 | Selleck Chemicals | -- | |
| Western blot | HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
| Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| Western blot, IHC, PLA, ChIP | HHEX抗体 | Abcam | ab34222 |
| Western blot, IP, IF, PLA | YAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376830 |
| Western blot | 磷酸化YAP S127抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 |
| Western blot, IF | TAZ抗体 | BD | 560235 |
| Western blot, PLA | TEAD4抗体 | Abcam | ab58310 |
| Western blot | TEAD1抗体 | Abclonal | A6768 |
| Western blot, IP | Pan-TEAD抗体 | Cell Signaling Technology | 13295 |
| Western blot | CTGF抗体 | Abclonal | A11067 |
| IHC | Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | D3B5 |
| Western blot | CK2α抗体 | Proteintech | 10992-1-AP |
| Western blot, IHC | Cleaved PARP-1抗体 | Abcam | ab32064 |
| Western blot | β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 |
| β-Tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 2128 | |
| LaminA/C抗体 | Cell Signaling Technology | 4777 | |
| IF和ChIP | 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 |
| IP, PLA和ChIP | 兔单克隆IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 3900 |
| IP, IF和PLA | 鼠单克隆IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 5415 |
| 邻近连接实验 | Duolink原位检测试剂盒 | Sigma | DUO92008 |
| 免疫荧光 | FITC标记二抗 | Invitrogen | A11008, A11012, A11005 |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光素酶报告基因实验 | TEAD荧光素酶报告基因 | Addgene | 34615 |
| 双荧光素酶报告基因检测 | Promega | -- | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG/HA/MYC磁珠 | Bimake | -- |
| Benzonase核酸酶 | Sigma | -- | |
| Western blot和免疫共沉淀 | cOmplete™蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| ChIP | Magna ChIP试剂盒 | Merk | 17-610 |
| 细胞活力检测 | Cell Counting Kit-8 | -- | -- |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | -- |
| AOM/DSS模型 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma | -- |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与培养 | 细胞系来源（ATCC）、STR鉴定、培养基（DMEM/高糖+10%胎牛血清+谷氨酰胺+青霉素）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods 'Cell lines and reagents' |
| 稳转细胞系构建 | 慢病毒/逆转病毒感染条件（8 μg/ml polybrene，24小时）、筛选条件（2 μg/ml嘌呤霉素1周或200 μg/ml潮霉素2周） 阅读提示：Methods 'Cell lines and reagents' |
| 免疫共沉淀 | 裂解缓冲液（0.3% NP-40）、磁珠孵育时间（4°C 3小时）、DNase处理条件（Benzonase，2 mM MgCl2，37°C 0.5小时） 阅读提示：Methods 'Western blot analysis and immunoprecipitation' |
| 荧光素酶报告基因实验 | TEAD报告基因质粒（Addgene 34615）、转染时间（24小时）、CX-4945处理方案（转染6小时后处理18小时） 阅读提示：Methods 'Luciferase reporter assay' |
| ChIP-seq和ChIP-qPCR | 细胞数量（1×10^6细胞/10 cm板，10板）、交联条件（1%甲醛10分钟）、超声片段大小（100-500 bp）、抗体用量 阅读提示：Methods 'ChIP and ChIP-seq analysis' |
| 裸鼠异种移植实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠，雄性，4-6周龄）、细胞接种量（1×10^6）、接种部位（右侧胁腹）、每组小鼠数（n=6）、实验终点（第21天或第18天） 阅读提示：Methods 'Mouse xenograft experiment' |
| 药物联用异种移植实验 | 给药起始肿瘤体积（约100 mm3）、CX-4945剂量（25 mg/kg，口服灌胃，每日两次）、维替泊芬剂量（25 mg/kg，腹腔注射，隔日一次）、给药时长（3周）、每组小鼠数（n=6） 阅读提示：Methods 'Mouse xenograft experiment' |
| AOM/DSS模型 | 小鼠品系（Villin-Hhexf/f，C57BL/6背景）、AOM剂量（10 mg/kg，腹腔注射，第1天）、DSS浓度（1.25%、1.5%、1.75%）和循环方案（7天DSS水+2周正常水，共三个循环）、实验终点（第65天） 阅读提示：Methods 'Mice and model of AOM/DSS-induced CRC' |
| 类器官培养与活力检测 | 小鼠年龄（4周龄）、类器官计数标准（直径≥20 μm）、PDO药物处理时间（CX-4945和VP处理72小时）、活力检测方法（CellTiter-Glo） 阅读提示：Methods 'Three-dimensional (3D) organoid culture and CellTiter-Glo 3D viability assay' |
| 患者样本IHC | 组织芯片来源（172对CRC和正常组织）、HHEX IHC评分标准（IRS<6为低表达，≥6为高表达）、随访时间（至2020年8月） 阅读提示：Methods 'Human tissue samples and immunohistochemistry' |