筛选HCC中失调的线粒体蛋白
系统鉴定HCC中转录失调的线粒体蛋白
分析TCGA HCC队列中1136个线粒体蛋白编码基因的表达，并在MYC+RAS小鼠肝脏肿瘤中通过RNA-seq验证差异表达基因，结合Kaplan-Meier分析筛选与生存相关的基因。
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FUNDC2通过抑制MFN1介导的线粒体融合促进肝脏肿瘤发生
FUNDC2 promotes liver tumorigenesis by inhibiting MFN1-mediated mitochondrial fusion.
实验完整度
高包含人HCC样本、小鼠肝脏肿瘤模型、多种细胞系，并进行了功能验证和机制验证
主要模型
MYC+RAS诱导的小鼠原位肝脏肿瘤模型 Huh-7人肝癌细胞系 HepG2人肝癌细胞系 人HCC临床样本
重点核对
MYC+RAS小鼠肝脏肿瘤模型中FUNDC2敲低及回补对肿瘤发生的影响（n=10，80天终点） Huh-7细胞中FUNDC2敲低及回补对线粒体形态和呼吸功能的影响 FUNDC2与MFN1的相互作用及结构域定位（免疫共沉淀） FUNDC2对MFN1 GTP酶活性及GTP结合的抑制效应 MFN1敲除对FUNDC2敲低表型的挽救实验（集落形成、ATP水平、代谢流）
摘要
线粒体产生ATP并在多种细胞活动中发挥调节作用。癌细胞常表现出线粒体碎片化。然而，其潜在机制仍不清楚。在此我们报道，一种线粒体蛋白FUN14结构域包含蛋白2（FUNDC2）在原发小鼠肝脏肿瘤中以及约40%的人肝细胞癌（HCC）中转录上调。重要的是，FUNDC2表达升高与患者生存率呈负相关，且其敲低抑制小鼠肝脏肿瘤发生。机制上，FUNDC2的氨基末端区域与线粒体融合蛋白1（MFN1）的GTP酶结构域相互作用，从而抑制其促进线粒体外膜融合的活性。因此，FUNDC2缺失导致线粒体伸长、线粒体呼吸降低以及细胞代谢重编程。这些结果确定了通过FUNDC2抑制MFN1导致癌症中线粒体碎片化的一种机制，并提示FUNDC2作为HCC的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HCC中线粒体碎片化的机制及其在肿瘤发生中的功能作用是什么？
- 核心机制
- FUNDC2通过其氨基末端区域与MFN1的GTP酶结构域结合，抑制MFN1的GTP酶活性和转式关联，从而抑制线粒体外膜融合，导致线粒体碎片化和代谢重编程。
- 主要证据
- 在MYC+RAS小鼠肝脏肿瘤模型中敲低FUNDC2抑制肿瘤发生且回补可挽救；在Huh-7和HepG2细胞中FUNDC2敲低导致线粒体伸长、呼吸降低和代谢重编程；MFN1敲除可挽救FUNDC2敲低的表型；免疫共沉淀和GTP结合实验证实FUNDC2抑制MFN1活性。
- 研究意义
- 确定了FUNDC2通过抑制MFN1导致线粒体碎片化的机制，并提示FUNDC2作为HCC的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FUNDC2在HCC中的表达及临床相关性
验证FUNDC2在HCC中的表达升高及其与患者生存的关系
在独立HCC队列中检测FUNDC2 mRNA水平，通过Western blot比较54对HCC和癌旁组织中FUNDC2蛋白水平，并利用Kaplan-Meier分析评估FUNDC2表达与总生存期的关系。
体内敲低FUNDC2对肝脏肿瘤发生的影响
确定FUNDC2在肝脏肿瘤发生中的功能作用
采用流体动力学尾静脉注射多重基因组编辑策略，将FUNDC2特异性shRNA与MYC+RAS癌基因同时导入小鼠肝细胞，观察肿瘤发生情况，并通过回补FUNDC2验证特异性。
FUNDC2对线粒体形态和功能的影响
探究FUNDC2如何影响线粒体结构和功能
在Huh-7细胞中敲低和回补FUNDC2，通过电子显微镜观察线粒体形态，Seahorse分析检测OCR和ECAR，测定细胞ATP水平，并在小鼠肿瘤中进行验证。
鉴定FUNDC2相互作用蛋白
寻找FUNDC2调控线粒体动力学的分子机制
在Huh-7细胞中表达FUNDC2-Flag-SBP，通过串联亲和纯化联合质谱鉴定相互作用蛋白，并通过免疫共沉淀验证FUNDC2与MFN1/2的相互作用。
解析FUNDC2与MFN1的相互作用结构域
确定介导FUNDC2与MFN1相互作用的关键区域
构建FUNDC2和MFN1的截短突变体，在HEK293T细胞中共转染并进行免疫共沉淀，分析相互作用区域；同时检测GTP酶活性突变体对相互作用的影响。
检测FUNDC2对MFN1 GTP酶活性的影响
验证FUNDC2是否抑制MFN1的GTP酶活性
通过体外GTP酶活性实验检测FUNDC2共表达对MFN1和MFN2活性的影响；利用GTP-琼脂糖珠pull-down实验检测FUNDC2对MFN1 GTP结合的影响，并在小鼠肿瘤和人HCC样本中验证。
验证MFN1在FUNDC2下游的功能必要性
确定FUNDC2调控线粒体动力学和代谢是否依赖于MFN1
利用CRISPR/Cas9构建MFN1或MFN2敲除Huh-7细胞，结合FUNDC2敲低，检测集落形成、线粒体形态、ATP水平、线粒体呼吸、糖酵解和脂肪酸氧化；并通过MFN1敲低挽救实验验证。
体内验证MFN1在FUNDC2促肿瘤发生中的必要性
验证FUNDC2是否通过抑制MFN1促进肝脏肿瘤发生
在小鼠肝脏肿瘤模型中同时敲低FUNDC2和MFN1，或回补MFN1野生型或W239A突变体，观察肿瘤发生、脂质积累和AFP表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 2289322 | |
| 原代细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | C11330500BT |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | SRP3196 | |
| 胰岛素 | YEASEN | 40112ES25 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher | R21001 | |
| 支原体检测 | 支原体检测试剂盒 | Vazyme | D101-01 |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 葡萄糖摄取实验 | 葡萄糖摄取检测试剂盒 | Abcam | ab136955 |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8375 | |
| 流式分析 | 四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐 | Invitrogen | M20036 |
| 线粒体绿色荧光探针 | Invitrogen | M7514 | |
| CMH2DCFDA活性氧探针 | Invitrogen | C6827 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 兔抗FUNDC2抗体 | US Biological | 035793 | |
| 兔抗MFN1抗体 | HUABio | ET1702-01 | |
| 兔抗MFN2抗体 | Proteintech | 12186-1-AP | |
| 鼠抗HNF4a抗体 | Cosmo Bio | PPX-PP-H1415-00 | |
| 兔抗磷酸化ACC抗体 | CST | 3661 | |
| 兔抗HA标签抗体 | CST | 3724 | |
| 兔抗HSP90抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| 鼠抗Myc标签抗体 | CST | 2276 | |
| 兔抗GFP抗体 | Abcam | 6556 | |
| 鼠抗β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 兔抗ATF-4抗体 | CST | 11815 | |
| 兔抗BiP抗体 | CST | 3177 | |
| 兔抗PERK抗体 | CST | 5683 | |
| 兔抗磷酸化PERK抗体 | CST | 3179 | |
| HRP标记二抗 | Invitrogen | A16096, 62-6520 | |
| 免疫共沉淀 | 无EDTA蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | S8830 |
| 蛋白G琼脂糖珠 | GE healthcare | 17-0618-01 | |
| 鼠抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | TaKaRa | 9109 |
| 第一链合成系统 | TaKaRa | RR036A | |
| SYBR Green | YEASEN | 11143ES50 | |
| GTP结合实验 | GTP-琼脂糖 | Sigma-Aldrich | G9768 |
| GTP酶活性实验 | GTP酶活性试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK113 |
| 免疫荧光染色 | 大鼠抗OLLAS抗体 | Novus Biologicals | NBP1-06713 |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P36941 | |
| Seahorse分析 | Seahorse XF 96细胞外通量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 寡霉素 | MedChemExpress | HY-N6782 | |
| FCCP | MedChemExpress | HY-100410 | |
| 鱼藤酮 | MedChemExpress | HY-B1756 | |
| 肉碱 | MedChemExpress | HY-B0399 | |
| 乙莫克舍 | MedChemExpress | HY-50202 | |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0026 |
| 串联亲和纯化 | 抗Flag M2树脂 | Sigma-Aldrich | F2426 |
| 3×Flag多肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| 链霉亲和素偶联树脂 | Agilent | 240105 | |
| 免疫组织化学 | 亲和素-生物素复合物系统 | Vector Laboratories | SP-2001, PK-6100 |
| 兔抗AFP抗体 | Abcam | ab46799 | |
| 鼠抗Ki67抗体 | BD | 556003 | |
| 组织学分析 | 油红 | Servicebio | G1015 |
| 荧光多重免疫组化 | Opal 7色手动IHC试剂盒 | AKOYA Biosciences | NEL811001KT |
| 代谢组学 | QTRAP 6500+质谱仪 | ABSCIEX | -- |
| SeQuant Zic-pHILIC色谱柱 | Millipore Sigma | -- | |
| [U-13C]葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| [U-13C]棕榈酸 | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| 脂质组学 | SCIEX QTOF 6600+质谱仪 | SCIEX | -- |
| ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 | Waters | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内敲低FUNDC2对肝脏肿瘤发生的影响 | 小鼠品系（4周龄雄性ICR）、质粒剂量（50 μg转座子+10 μg转座酶）、注射体积（体重的10%）、终点时间（80天）、样本量（n=10） 阅读提示：Methods中Animal model部分；Fig. 2d, e图注 |
| FUNDC2对线粒体形态的影响 | 细胞系（Huh-7）、FUNDC2敲低和回补方式、电子显微镜定量线粒体长度的方法（n=50线粒体） 阅读提示：Methods中Transmission electron microscopy部分；Fig. 3c, d图注 |
| FUNDC2对线粒体呼吸和糖酵解的影响 | Seahorse分析中细胞接种密度（10,000细胞/孔）、注射药物浓度（oligomycin 1 μM、FCCP 0.5 μM、antimycin A 1 μM+rotenone）、归一化方法（总蛋白） 阅读提示：Methods中Seahorse assay部分；Fig. 3g, h图注 |
| FUNDC2与MFN1的相互作用结构域 | FUNDC2截短突变体（1-127等）、MFN1截短突变体（1-336、1-584等）、GTP酶活性突变体（K88T、K222Q、W239A）、免疫共沉淀条件 阅读提示：Methods中Plasmid construction和Western blotting and immunoprecipitation部分；Fig. 4d-h图注 |
| MFN1敲除对FUNDC2敲低表型的挽救 | MFN1敲除细胞系构建（CRISPR/Cas9 sgRNA序列）、FUNDC2敲低效率、集落形成实验细胞数（5000细胞/孔）和培养时间（2周）、Seahorse分析条件 阅读提示：Methods中Plasmid construction、Tissue culture和Seahorse assay部分；Fig. 6a, f图注 |