LECT2对RIG-I介导天然免疫的调控验证
验证LECT2是否正向调控RIG-I介导的IFN应答。
构建LECT2过表达HepG2细胞，使用重组LECT2蛋白处理细胞，转染HCV-RNA或Poly(I:C)，检测IFNB1、ISG表达及IRF3磷酸化；利用siRNA敲低RIG-I或MDA5；在Lect2-TG和KO小鼠中注射Poly(I:C)检测肝脏Ifnb1和ISG表达。
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白细胞细胞来源趋化因子2是通过原癌基因MET发挥作用的抗病毒调节因子
Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 is an antiviral regulator acting through the proto-oncogene MET.
实验完整度
高包含细胞系、原代肝细胞、转基因/敲除小鼠和患者样本，并有功能验证和机制验证
主要模型
HepG2细胞系 KH细胞系 LECT2转基因和敲除小鼠 慢性丙型肝炎患者肝组织
重点核对
r-LECT2处理浓度50 ng/mL，处理1小时 HCV-RNA转染后12小时检测IFNB1表达 LCMV感染剂量1.0×10^4 pfu（低剂量）或1.0×10^6 pfu（高剂量），腹腔注射 LCMV感染后7天检测肝脏病毒载量 HGF处理浓度5和10 ng/mL，处理1小时
摘要
视黄酸诱导基因（RIG）-I是识别病原体RNA并诱导干扰素（IFN）产生的关键天然免疫传感器。然而，宿主蛋白如何调控RIG-I活化的机制尚不清楚。本研究发现，白细胞细胞来源趋化因子2（LECT2）作为一种肝细胞因子和MET受体酪氨酸激酶的配体，是促进RIG-I介导的天然免疫应答的抗病毒调节因子。LECT2与MET结合后，诱导磷酸酶PTP4A1募集至MET，并促进磷酸化SHP2从MET上解离和去磷酸化，从而保护RIG-I免受SHP2/c-Cbl介导的降解。在体内，LECT2过表达增强RIG-I依赖的IFN产生并抑制淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）在肝脏中的复制，而这些变化在LECT2敲除小鼠中被逆转。强制抑制MET可在体外和体内消除IFN产生和抗病毒活性。有趣的是，原始的MET配体肝细胞生长因子（HGF）抑制LECT2介导的抗病毒信号；反之，LECT2-MET信号与HGF-MET信号竞争。我们的发现揭示了MET介导的增殖与天然免疫之间此前未被认识的交叉对话，并提示靶向LECT2可能在感染性疾病和癌症中具有治疗价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LECT2是否及如何通过MET调控RIG-I介导的天然免疫应答和抗病毒反应。
- 核心机制
- LECT2与MET结合后诱导PTP4A1募集至MET，促使SHP2去磷酸化并从MET解离，从而抑制SHP2/c-Cbl介导的RIG-I K48连接泛素化和降解，增强RIG-I-IFN信号。
- 主要证据
- 在HepG2、KH细胞及原代小鼠肝细胞中，LECT2过表达或重组蛋白增强HCV-RNA或Poly(I:C)诱导的IFNB1和ISG表达，且依赖RIG-I和MET；在Lect2-TG和KO小鼠中，LECT2增强或削弱Poly(I:C)及LCMV诱导的Ifnb1表达并影响病毒载量；MET敲低或敲除消除LECT2的抗病毒作用。
- 研究意义
- 揭示了MET介导的增殖与天然免疫之间的交叉对话，提示靶向LECT2可能在感染性疾病和癌症中具有治疗价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LECT2抗病毒功能的体内外验证
验证LECT2是否抑制HCV和LCMV复制。
在KH细胞中转染H77S.3/GLuc-RNA并检测GLuc活性；在Lect2-TG和KO小鼠中腹腔注射LCMV，检测肝脏病毒载量和Ifnb1表达；给WT小鼠静脉注射重组鼠LECT2后感染LCMV，检测病毒载量。
MET在天然免疫中的作用验证
验证MET是否参与RIG-I介导的天然免疫应答。
利用CRISPR-Cas9构建MET-KO HepG2细胞，转染Poly(I:C)检测IFNB1；使用LNA-Gapmer沉默小鼠肝脏Met表达，感染LCMV后检测Ifnb1和病毒载量；用HGF处理HepG2细胞，检测MET下游信号和RIG-I泛素化。
LECT2通过MET调控天然免疫的验证
验证MET是否为LECT2介导天然免疫活化所必需。
在HepG2细胞中共转染FLAG-LECT2和MET质粒，共免疫荧光检测共定位；用MET siRNA敲低MET，检测r-LECT2诱导的IFNB1；在HepG2-MET-KO细胞中转染HCV-RNA，检测IFNB1和HCV复制。
LECT2通过抑制MET Tyr1349磷酸化激活天然免疫
确定LECT2影响MET的具体磷酸化位点。
将MET WT、Y1234/1235F、Y1349F、Y1356F或Y1349D突变体转染HepG2-MET-KO细胞，r-LECT2处理后转染HCV-RNA，检测IFNB1表达和MET磷酸化。
SHP2在LECT2介导RIG-I稳定中的作用验证
验证LECT2是否通过抑制SHP2来稳定RIG-I。
用r-LECT2处理HepG2细胞，检测GAB1和SHP2磷酸化；构建SHP2-KO HepG2和KH细胞，检测r-LECT2对IFNB1的诱导；使用SHP2抑制剂SHP099处理细胞；在HepG2-RIG-I-KO细胞中共转染RIG-I、HA-ubiquitin、SHP2和LECT2，检测RIG-I泛素化。
PTP4A1在LECT2增强天然免疫中的作用验证
验证PTP4A1是否介导LECT2对MET和SHP2的调控。
在HepG2和KH-MET-KO细胞中共转染MET和PTP4A1，r-LECT2处理后检测IFNB1和HCV复制；构建PTP4A1-KO细胞，检测LECT2对IFNB1的增强作用；免疫共沉淀检测MET、PTP4A1、p-SHP2和c-Cbl的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Life Technologies | -- | |
| EGMTM-2内皮细胞生长培养基-2 BulletKitTM | Lonza | -- | |
| 药物处理 | 聚肌胞苷酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SHP099 | Cayman Chemical | -- | |
| 重组人肝细胞生长因子蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | 3743 |
| 抗MDA5抗体 | Cell Signaling Technology | 5321 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 83611 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗磷酸化MET (Tyr1234/1235)抗体 | Cell Signaling Technology | 3077 | |
| 抗磷酸化MET (Tyr1349)抗体 | Cell Signaling Technology | 3121 | |
| 抗MET抗体 | Cell Signaling Technology | 3127 | |
| 抗磷酸化GAB1抗体 | Cell Signaling Technology | 12745 | |
| 抗GAB1抗体 | Cell Signaling Technology | 3232 | |
| 抗磷酸化SHP2抗体 | Cell Signaling Technology | 5431 | |
| 抗SHP2抗体 | Cell Signaling Technology | 3397 | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗DC-SIGN抗体 | Cell Signaling Technology | 13193 | |
| 抗DYKDDDDK标签（FLAG）抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗β-肌动蛋白（ACTB）抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗磷酸酪氨酸抗体 | Merck Millipore | 05-321 | |
| 抗K48-泛素抗体 | Merck Millipore | 05-1307 | |
| 抗PTP4A1（PRL-1）抗体 | Abcam | ab168643 | |
| 抗LECT2抗体 | Abcam | ab119429 | |
| 抗磷酸化MET (Tyr1356)抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-40218 | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | High Pure RNA分离试剂盒 | Roche Applied Science | -- |
| RT-qPCR | High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| 7900HT实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| GLuc报告基因检测 | GloMax-Multi检测系统 | Promega | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | EMD Millipore | -- |
| complete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Applied Science | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche Applied Science | -- | |
| Blocking One或Blocking One-P封闭液 | Nacalai Tesque | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- |
| RIP检测试剂盒 | MBL | -- | |
| 免疫荧光 | Dragonfly CR-DFLY-301共聚焦成像系统 | Oxford Instruments | -- |
| 重组蛋白纯化 | Hi-Trap肝素柱 | GE Healthcare | -- |
| cOmplete His标签纯化柱 | Roche | -- | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 慢病毒包装 | Lenti-X 293T细胞 | Takara Bio | -- |
| 慢病毒高滴度包装混合物 | Takara Bio | -- | |
| FuGENE-HD转染试剂 | Promega | -- | |
| CRISPR-Cas9基因编辑 | 第三代包装系统混合物 | Applied Biological Materials | -- |
| 定点突变 | QuikChange定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 体外转录 | T7 RiboMAX™ Express大规模RNA生产系统 | Promega | -- |
| RNA纯化 | RNeasy Mini试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LECT2对RIG-I介导天然免疫的调控验证 | r-LECT2处理浓度（50 ng/mL）和处理时间（1小时）；HCV-RNA或Poly(I:C)转染后检测时间点（6小时、12小时）；HepG2-LECT2细胞构建方法（慢病毒表达系统） 阅读提示：Methods中“Recombinant LECT2 protein”和“HCV-RNA and Poly(I:C) transfection”小节；Fig. 1图注 |
| LECT2抗病毒功能的体内验证 | LCMV感染剂量（1.0×10^4 pfu或1.0×10^6 pfu）、感染途径（腹腔注射）、检测时间点（感染后7天）；r-mLect2剂量（50 μg）和注射途径（静脉注射） 阅读提示：Methods中“Viruses”和“Mice”小节；Fig. 2图注 |
| MET在天然免疫中的作用验证 | MET-KO细胞构建方法（CRISPR-Cas9）；Met Gapmer注射剂量和途径（静脉注射）、LCMV感染剂量（1.0×10^4 pfu）和检测时间点（感染后5天）；HGF处理浓度（5和10 ng/mL）和时间（1小时） 阅读提示：Methods中“Establishment of MET, SHP2, PTP4A1 and RIG-I KO cell lines”和“Plasmids, miRNAs and Gapmer”小节；Fig. 3图注 |
| LECT2通过MET调控天然免疫的验证 | r-LECT2处理浓度（50 ng/mL）和时间（1小时）；HCV-RNA转染后检测时间点（12小时）；miR-122共转染条件 阅读提示：Methods中“HCV-RNA and Poly(I:C) transfection”小节；Fig. 4图注 |
| LECT2通过抑制MET Tyr1349磷酸化激活天然免疫 | MET突变体质粒转染方法；r-LECT2处理浓度（50 ng/mL）和时间（1小时）；HCV-RNA转染后检测时间点（12小时） 阅读提示：Methods中“Plasmids, miRNAs and Gapmer”小节；Fig. 5图注 |
| SHP2在LECT2介导RIG-I稳定中的作用验证 | SHP2-KO细胞构建方法；SHP099处理浓度（文中未明确说明）和处理时间（文中未明确说明）；MG132处理条件（文中未明确说明） 阅读提示：Methods中“Establishment of MET, SHP2, PTP4A1 and RIG-I KO cell lines”小节；Fig. 6图注 |
| PTP4A1在LECT2增强天然免疫中的作用验证 | PTP4A1-KO细胞构建方法；r-LECT2处理浓度（50 ng/mL）和时间（1小时）；免疫共沉淀使用抗体（抗MET抗体） 阅读提示：Methods中“Establishment of MET, SHP2, PTP4A1 and RIG-I KO cell lines”和“Immunoprecipitation”小节；Fig. 7和图8图注 |