CRC患者粪便菌群分析
鉴定在CRC患者中富集且与CRC相关的肠道细菌分类群。
收集健康人和CRC患者粪便，进行16S rRNA基因V1-V2区测序，用LEfSe等分析差异OTU，并在独立队列中验证及比较手术前后。
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在结直肠癌患者中鉴定出的肠道细菌通过分泌丁酸促进肿瘤发生
Gut bacteria identified in colorectal cancer patients promote tumourigenesis via butyrate secretion.
实验完整度
高含两项患者队列16S测序、细胞及类器官衰老模型、体内ApcΔ14/+小鼠验证和丁酸合成基因突变机制验证
主要模型
CRC患者与健康人粪便样本队列（Cohort-1和Cohort-2） 人二倍体成纤维细胞TIG-3及正常人结肠上皮细胞CCD 841 CoN 人iPS细胞来源的肠道类器官 ApcΔ14/+小鼠
重点核对
Cohort-1：384名健康人和380名CRC患者（含63例早期CRC）的粪便16S rRNA基因V1-V2区测序 Cohort-2：129名健康人、136例早期CRC和153例晚期CRC患者粪便16S rRNA基因测序 细菌条件培养基按1/30体积比处理细胞9天，每3天换液，随后无细菌培养基培养3天或7天 丁酸处理浓度：P. gingivalis条件培养基中为1.53 mM，P. asaccharolytica条件培养基中为0.69 mM；阳性对照DXR 200 ng/ml或3 mM丁酸钠 ApcΔ14/+小鼠每两天灌胃1×10^8 CFU细菌，持续8周；ABT-263为100 mg/kg，每周5次，共4周
摘要
新出现的证据表明，肠道菌群的改变与结直肠癌（CRC）相关。然而，目前对于肠道菌群改变是否以及如何与CRC发展存在因果关联知之甚少。本文中，我们在两项独立队列研究中发现，12个粪便细菌分类群在CRC患者中富集。其中，2种卟啉单胞菌属物种能够通过分泌细菌代谢物丁酸诱导细胞衰老，这是一种致癌性应激反应。值得注意的是，在CRC组织中观察到这些细菌的侵入，同时丁酸水平升高和衰老相关炎症表型的迹象并存。此外，尽管将这些细菌给予ApcΔ14/+小鼠会加速结直肠肿瘤的发生，但当细菌的丁酸合成基因被破坏时则不会出现这种情况。这些结果表明，卟啉单胞菌属物种过度生长与结直肠肿瘤发生之间存在因果关系，这可能由丁酸诱导的衰老所致。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌患者中增加的肠道细菌是否以及如何与结直肠癌发生存在因果关联。
- 核心机制
- Porphyromonas gingivalis和Porphyromonas asaccharolytica通过分泌丁酸诱导细胞衰老及SASP，从而促进结直肠肿瘤发生。
- 主要证据
- 两项CRC患者队列的16S rRNA测序鉴定出12个富集细菌分类群；细菌条件培养基在HDF、正常结肠上皮细胞和iPS来源肠道类器官中诱导衰老标志；CRC组织中检测到细菌侵入、丁酸升高和衰老标志；ApcΔ14/+小鼠灌胃实验显示细菌加速肿瘤发生，而丁酸合成缺陷突变株作用减弱。
- 研究意义
- 研究提示肠道菌群改变与CRC发展可能存在因果关联，为理解肠道细菌与CRC发生的关系及CRC控制提供了新线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细菌条件培养基诱导细胞衰老
验证CRC富集细菌是否具有诱导潜在致癌性刺激的能力。
用10种CRC富集细菌的条件培养基处理早期传代人二倍体成纤维细胞，检测细胞周期停滞、衰老标志基因和蛋白、ROS、DNA损伤及凋亡标志。
正常肠上皮细胞和肠道类器官验证
验证候选细菌在肠道相关细胞和类器官中是否诱导衰老样表型。
用候选细菌条件培养基处理正常人结肠上皮细胞CCD 841 CoN和iPS来源肠道类器官，检测衰老标志基因、EdU掺入及衰老相关标志。
鉴定丁酸为关键分泌因子
确定介导衰老诱导的细菌代谢物。
检测细菌培养上清中短链脂肪酸浓度，用相同浓度丁酸或SCFA混合物处理细胞，进行RNA测序比较基因表达谱，并检测丁酸合成基因缺陷突变株的衰老诱导能力。
CRC组织中细菌侵入与衰老标志检测
在人体CRC组织中验证丁酸产生菌侵入与细胞衰老的关系。
对手术切除的CRC组织进行物种特异性原位杂交检测细菌，免疫染色检测p16INK4a、IL-6和αSMA，并测定肿瘤与非肿瘤组织中丁酸浓度。
ApcΔ14/+小鼠体内肿瘤促进实验
验证丁酸产生菌是否在体内加速结直肠肿瘤发生，并确认丁酸的作用。
给6周龄ApcΔ14/+小鼠灌胃PBS、P. asaccharolytica、P. gingivalis、F. nucleatum或丁酸合成缺陷突变株，检测结直肠肿瘤数量；另用ABT-263处理观察衰老细胞清除的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 粪便样本采集 | 粪便采样工具 | TechnoSuruga Laboratory | -- |
| 粪便细菌DNA提取 | QIAamp粪便DNA快速提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Magtration System 12GC核酸提取仪 | Precision System Science | -- | |
| 16S rRNA基因扩增 | KOD FX Neo DNA聚合酶 | TOYOBO | -- |
| 16S rRNA基因测序 | Illumina MiSeq测序平台 | Illumina | -- |
| MiSeq试剂盒V2 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| Eagle最低必需培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 类器官培养 | Matrigel基质胶 | -- | -- |
| 高级DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| B-27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 鼠表皮生长因子 | Peprotech | -- | |
| p38 MAPK抑制剂SB202190 | Sigma-Aldrich | -- | |
| TGFβ受体抑制剂A83-01 | Tocris | -- | |
| ROCK抑制剂Y-27632 | Wako | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara Bio Inc. | -- |
| SYBR Premix EX Taq预混液 | Takara Bio Inc. | -- | |
| StepOnePlus PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Nacalai Tesque | -- | |
| 蛋白定量试剂盒 | Takara Bio Inc. | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | EMD Millipore | -- | |
| p16INK4a抗体 | IBL | 11104 | |
| p21Cip1/Waf1抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| Lamin B1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| RB抗体 | Santa Cruz | sc-102 | |
| 磷酸化RB (Ser780)抗体 | Cell Signaling Technology | 9307 | |
| p53抗体 | Santa Cruz | sc-6243 | |
| 磷酸化p53 (Ser15)抗体 | Cell Signaling Technology | 9284 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗兔IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Amersham ECL prime/select化学发光试剂 | GE Healthcare | -- | |
| LAS-3000mini成像系统 | Fujifilm | -- | |
| ROS测定 | DCF-DA荧光探针 | Calbiochem | -- |
| ARVO MX/Light 1420多标记/发光计数器 | PerkinElmer | -- | |
| 免疫荧光 | γ-H2AX抗体 | Millipore | 05-636 |
| 磷酸化(Ser/Thr) ATM/ATR底物(pST/Q)抗体 | Cell Signaling Technology | 2851 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175)抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| 驴抗兔IgG Alexa Fluor 594二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | |
| 驴抗兔IgG Alexa Fluor Plus 555二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-32794 | |
| DAPI核染料 | Dojindo | -- | |
| BZ-X710荧光显微镜 | KEYENCE | -- | |
| FLUOVIEW FV3000共聚焦激光扫描显微镜 | OLYMPUS | -- | |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂 | MBL Life Science | 4700-100 |
| 碘化丙啶溶液 | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| EdU掺入实验 | Click-iT Plus EdU细胞增殖成像试剂盒Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | C10638 |
| RNA测序 | TruSeq链特异性mRNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| 组织学分析 | 链霉亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 免疫组化 | p16抗体 | Abcam | ab211542 |
| p21抗体 | Abcam | ab107099 | |
| IL-6抗体 | Abcam | ab6672 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| 山羊抗大鼠IgG二抗 | Vector Laboratories | BA-9400 | |
| 人CRC组织免疫组化 | p16抗体 | Abgent | ALS16384 |
| 免疫组化 | Leica Bond III自动化免疫组化和原位杂交系统 | Leica Microsystems | -- |
| BX53正置显微镜 | OLYMPUS | -- | |
| 免疫荧光 | α-SMA抗体 | Sigma-Aldrich | A5228 |
| 人CRC组织免疫荧光 | α-SMA抗体 | Abcam | ab125057 |
| p16抗体 | Abcam | ab81278 | |
| 原位杂交 | RNAscope 2.5 HD试剂盒-RED | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 322350 |
| RNAscope P. asaccharolytica 23S rRNA探针 | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 838331 | |
| RNAscope P. gingivalis 23S rRNA探针 | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 843341 | |
| rpoB基因克隆 | pGEM-T载体 | Promega | A3600 |
| 质粒DNA提取 | FavorPrep质粒DNA提取微型试剂盒 | Favorgen | FAPDE001-1 |
| DNA测序 | Applied Biosystems 3500xL基因分析仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物实验 | ABT-263 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 粪便样本采集与队列 | Cohort-1和Cohort-2的入组人数、排除标准、样本采集时间点（结肠镜检查、抗生素、化疗、放疗前） 阅读提示：Methods中Human faecal sample collection小节及Supplementary Fig. 1a、Supplementary Fig. 2 |
| 16S rRNA基因测序分析 | V1-V2区扩增循环数、测序平台、OTU聚类相似度阈值、LEfSe分析参数 阅读提示：Methods中16S rRNA gene-sequencing analysis and microbiome analysis小节 |
| 细菌条件培养基处理细胞 | 条件培养基制备方法、处理比例1/30、处理时长9天及换液频率 阅读提示：Methods中Bacterial strain and culture conditions和Cell culture小节，Fig. 2a及Fig. 3a图注 |
| 丁酸浓度与SCFA处理 | P. gingivalis和P. asaccharolytica条件培养基中丁酸浓度（1.53 mM和0.69 mM）、丁酸钠使用浓度3 mM、DXR浓度200 ng/ml 阅读提示：Fig. 4a–c图注及Results中Porphyromonas species provoke cellular senescence via butyrate secretion小节 |
| ApcΔ14/+小鼠灌胃实验 | 小鼠周龄（6周）、灌胃剂量（1×10^8 CFU）、灌胃频率（每两天）、持续时间（8周）、每组样本量、ABT-263剂量和给药方案 阅读提示：Methods中Animal experiment小节及Fig. 5d–f图注 |