建立同基因肺癌细胞系
构建表达不同癌基因的同基因PC9细胞系，以研究癌基因特异性依赖性。
在PC9-Cas9细胞中通过慢病毒转导表达Firefly luciferase（对照）、RIT1M90I、KRASG12V或EGFRT790M/L858R，并用潮霉素筛选。
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整合性癌基因依赖性图谱鉴定RIT1在肺癌中的脆弱性与协同作用
Integrative oncogene-dependency mapping identifies RIT1 vulnerabilities and synergies in lung cancer.
实验完整度
高同基因细胞系CRISPR筛选、小分子筛选、机制验证（有丝分裂时序）、多种细胞模型及体内异种移植验证。
主要模型
PC9 EGFR突变型肺腺癌细胞系（同基因表达RIT1M90I、KRASG12V或EGFRT790M/L858R） NCI-H2110 RIT1M90I突变型非小细胞肺癌细胞系 SALE人小气道上皮细胞（表达RIT1M90I和/或YAP15SA） HeLa H2B-GFP细胞（表达RIT1M90I）
重点核对
PC9同基因细胞系中RIT1M90I、KRASG12V和EGFRT790M/L858R的表达及对erlotinib（40-50 nM）的抗性 全基因组CRISPR筛选（Brunello文库）在erlotinib或DMSO条件下培养约12个群体倍增 验证筛选使用定制sgRNA文库（1288个基因）在PC9-Cas9-RIT1M90I细胞中进行 HeLa H2B-GFP细胞中有丝分裂时序分析（NEBD到后期起始），n=50细胞/条件 SALE细胞异种移植模型中RIT1M90I+YAP15SA或sgNF2的肿瘤生长（n=6-8肿瘤/组）
摘要
基于CRISPR的癌症依赖性图谱正在加速癌症精准医学的进展，但足够的功能性图谱仅限于最常见的癌基因。为了在其他较罕见的癌症亚群中寻找治疗干预的机会，我们研究了肺癌癌基因RIT1所赋予的癌基因特异性依赖性。在此，我们在KRAS、EGFR和RIT1突变型同基因肺癌细胞中进行全基因组CRISPR筛选，鉴定了每种癌基因共有和独特的脆弱性。将这些遗传数据与小分子敏感性分析相结合，我们鉴定了RIT1突变细胞对纺锤体组装检查点调节因子缺失的独特脆弱性。致癌性RIT1M90I削弱纺锤体组装检查点并扰乱有丝分裂时序，导致对Aurora A抑制的敏感性。此外，我们在多种模型中观察到突变型RIT1与YAP1激活之间的协同作用，并且在人原发性RIT1突变型肺肿瘤中频繁观察到YAP1的核过表达。这些结果提供了致癌性RIT1功能相互作用的基因组范围图谱，并确定了RAS通路、纺锤体组装检查点和Hippo/YAP1网络的组分作为RIT1突变型肺癌的候选治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RIT1突变型肺癌的癌基因特异性依赖性是什么，以及如何利用这些依赖性进行靶向治疗？
- 核心机制
- 致癌性RIT1M90I削弱纺锤体组装检查点，导致有丝分裂时序加速和对Aurora激酶抑制的敏感性；同时，RIT1M90I与YAP1激活协同促进肿瘤发生，可能通过增强YAP1靶基因表达实现。
- 主要证据
- 同基因PC9细胞系的全基因组CRISPR筛选和验证筛选、小分子敏感性分析、HeLa细胞有丝分裂时序分析、SALE细胞转化和异种移植模型，以及人RIT1突变型肺肿瘤中YAP1核过表达的免疫组化分析。
- 研究意义
- 提供了致癌性RIT1功能相互作用的基因组范围图谱，并确定了RAS通路、纺锤体组装检查点和Hippo/YAP1网络组分作为RIT1突变型肺癌的候选治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组CRISPR筛选
鉴定在erlotinib选择压力下各癌基因特异性依赖的基因。
使用Brunello文库（76,441 sgRNAs靶向19,114个基因）转导PC9-Cas9同基因细胞，在erlotinib或DMSO中培养约12个群体倍增，通过测序分析sgRNA丰度变化。
小分子敏感性筛选
评估RIT1M90I和KRASG12V细胞对160种小分子的敏感性差异。
在PC9-RIT1M90I和PC9-KRASG12V细胞中，联合500 nM erlotinib测试160种小分子（8个剂量点），96小时后用CellTiterGlo检测细胞活力。
验证筛选与单基因敲除验证
验证全基因组筛选鉴定的关键依赖性基因。
使用定制sgRNA文库（1000个非靶向对照和11,333个sgRNAs靶向1288个基因）在PC9-Cas9-RIT1M90I细胞中进行二次筛选；并对SHOC2、AURKA、USP9X等基因进行单独敲除验证。
有丝分裂时序和染色体异常分析
研究RIT1M90I对纺锤体组装检查点和有丝分裂保真度的影响。
在HeLa H2B-GFP细胞中表达RIT1M90I，使用活细胞荧光显微镜追踪从核膜破裂（NEBD）到后期起始的时间，并分析染色体异常。
体外转化和体内成瘤实验
验证RIT1M90I与YAP1激活的协同作用以及关键依赖性基因在体内的作用。
在SALE细胞中表达RIT1M90I和/或YAP15SA或敲除NF2，观察细胞形态和软琼脂生长，并进行免疫缺陷小鼠异种移植实验；使用多西环素诱导型Cas9系统在体内敲除RIT1、AURKA、IGF1R或FURIN。
人肺肿瘤样本分析
探究RIT1突变型人肺腺癌中Hippo通路基因表达和YAP1核定位情况。
分析TCGA肺腺癌RNA-seq数据（230样本）中RIT1突变或扩增肿瘤的基因表达；对MSK-IMPACT鉴定的RIT1突变型肿瘤进行YAP1免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 杜尔贝科改良鹰培养基 | Genesee Scientific | -- | |
| 小气道上皮生长培养基 | PromoCell or Lonza | -- | |
| 慢病毒生产 | TransIT-LTI转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| OptiMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞系构建 | 嘌呤霉素 | Sigma | -- |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| G418/遗传霉素 | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
| CRISPR筛选 | Brunello慢病毒文库 | Broad Institute Genetic Perturbation Platform | 73179-LV |
| QIAamp DNA血液大提试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| ExTaq聚合酶 | Takara Bio | -- | |
| Agencourt AMPure XP SPRI磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 药物处理 | 厄洛替尼 | SelleckChem | S1023 |
| 奥希替尼 | SelleckChem | S7297 | |
| Torin 1 | SelleckChem | S2827 | |
| Alisertib | SelleckChem | S1133 | |
| Barasertib | SelleckChem | S1147 | |
| Reversine | Selleckchem | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiterGlo试剂 | Promega | -- |
| Envision多标记板阅读仪 | PerkinElmer | -- | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Trans-blot Turbo转膜系统 | BioRad | -- | |
| iBlot转膜系统 | Invitrogen | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | BioRad | -- | |
| 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| 磷酸化MEK1/2 (Ser217/221)抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| MEK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2352 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 2920 | |
| EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 2239 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| Vinculin抗体 | Sigma | V9264 | |
| 萤火虫荧光素酶抗体 | Abcam | Ab16466 | |
| RIT1抗体 | Abcam | Ab53720 | |
| KRAS抗体 | Sigma | WH0003845M1 | |
| NF2抗体 | Abcam | Ab109244 | |
| USP9X抗体 | Proteintech | 55054-1-AP | |
| SHOC2/Sur-8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514779 | |
| IGF1R抗体 | Cell Signaling Technology | 9750 | |
| FURIN抗体 | Thermo Scientific | PA1-062 | |
| AURKA抗体 | Cell Signaling Technology | 4718 | |
| 免疫组化 | YAP1抗体（克隆63.7） | Santa Cruz | -- |
| Bond Polymer Refine DAB IHC检测试剂盒 | -- | -- | |
| RT-qPCR | SuperScript IV第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| ITGB2 TaqMan基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs00164957_m1 | |
| TNNT2 TaqMan基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs00943911_m1 | |
| COL4A3 TaqMan基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs01022502_m1 | |
| 18S TaqMan基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | |
| BioRad CFX384实时系统 | BioRad | -- | |
| RNA-seq | Direct-zol RNA小量提取plus试剂盒 | Zymo Research | -- |
| Illumina TruSeq试剂盒 | Illumina | -- | |
| 活细胞成像 | Leica DMi8显微镜 | Leica | -- |
| Andor CSU转盘单元 | Andor | -- | |
| Andor iXon Ultra 888 EMCCD相机 | Andor | -- | |
| MetaMorph软件（v7.10.0.119） | Molecular Devices | -- | |
| 免疫荧光 | 含DAPI的Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| Nunc Lab-Tek腔室载玻片 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组CRISPR筛选 | 细胞系（PC9-Cas9同基因表达RIT1M90I、KRASG12V、EGFRT790M/L858R或Luciferase对照）、文库（Brunello）、MOI（<0.3）、嘌呤霉素浓度（1 μg/mL）、erlotinib浓度（40 nM）、培养时长（约12个群体倍增）、生物学重复数（2-3） 阅读提示：Methods 'Genome-wide CRISPR gene knockout screen' 和 Figure 2b |
| 小分子敏感性筛选 | 细胞系（PC9-RIT1M90I和PC9-KRASG12V）、erlotinib固定浓度（500 nM）、小分子库（160种化合物，8剂量点）、处理时间（96小时）、技术重复数（2） 阅读提示：Methods 'Small-molecule drug screen' 和 Figure 5a |
| 有丝分裂时序分析 | 细胞系（HeLa H2B-GFP表达RIT1M90I或亲本）、 reversine浓度（0.5 μM）或alisertib浓度（1 μM）、处理时间（成像前2小时）、成像频率（每分钟一次，18小时）、分析细胞数（50细胞/条件） 阅读提示：Methods 'Mitotic timing and chromosomal aberration analysis' 和 Figure 6c, h |
| 异种移植实验 | 细胞系（SALEiCas9表达RIT1M90I+YAP15SA或sgNF2）、细胞数量（2×10^6）、注射部位（皮下）、小鼠品系（NU/J）、每组肿瘤数（6-8）、多西环素给药方式（625 ppm chow） 阅读提示：Methods 'In vivo xenograft studies and ethical approval' 和 Figure 7g-l |
| TCGA数据分析 | RIT1改变定义（突变或扩增）、样本量（RIT1改变37例，非改变193例）、差异表达分析q值阈值（<=0.25）、Hippo通路基因列表 阅读提示：Methods 'TCGA RNA expression analysis' 和 Figure 8a-b |