定量蛋白质组学筛选端粒结合蛋白
鉴定与秀丽隐杆线虫端粒序列结合的新蛋白
用生物素化串联端粒序列(TTAGGC)n或对照序列(AGGTCA)n与妊娠成虫核提取物孵育，进行DNA下拉，分别用无标记定量和还原性二甲基标记定量蛋白质组学分析。
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双链DNA结合蛋白TEBP-1和TEBP-2与POT-1形成端粒复合体
The double-stranded DNA-binding proteins TEBP-1 and TEBP-2 form a telomeric complex with POT-1.
实验完整度
高包含体外DNA下拉、荧光偏振、体内荧光共定位、突变体端粒长度分析、遗传杂交、IP-qMS、Y2H、SEC等多层验证。
主要模型
秀丽隐杆线虫N2野生型及tebp-1、tebp-2突变体 秀丽隐杆线虫胚胎和年轻成虫蛋白提取物 重组表达TEBP-1、TEBP-2、POT-2的大肠杆菌
重点核对
tebp-1(xf133)和tebp-2(xf131)突变体分别培养约98-124代后进行端粒长度分析 qFISH分析成年生殖系和胚胎端粒长度，每组n=9-11只独立动物 荧光偏振测定TEBP-1-His5和TEBP-2-His5与FITC标记端粒DNA的亲和力，每个数据点n=3技术重复 tebp-1和tebp-2杂交后F2/F3代育性计数，温度20°C和25°C
摘要
端粒由专门的蛋白质结合，这些蛋白质保护端粒免受DNA损伤并调控端粒长度稳态。在秀丽隐杆线虫中，目前尚缺乏对与端粒序列相互作用的蛋白质的全面了解。在此，我们利用定量蛋白质组学方法鉴定了TEBP-1和TEBP-2，这两个旁系同源蛋白在生殖系和胚胎发生中表达，并在体外和体内与端粒相关联。tebp-1和tebp-2突变体表现出显著不同的表型：tebp-1突变体的端粒比野生型动物更长，而tebp-2突变体显示端粒缩短和生殖系死亡。值得注意的是，tebp-1;tebp-2双突变体动物具有合成不育性，其生殖系显示出严重的丝分裂和减数分裂停滞迹象。此外，我们证明POT-1与TEBP-1和TEBP-2形成端粒复合体，该复合体将TEBP-1/-2与POT-2/MRT-1桥接起来。这些结果为了解秀丽隐杆线虫端粒蛋白复合体的组成和组织提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 秀丽隐杆线虫中是否存在双链端粒结合蛋白，它们如何组成端粒复合体并调控端粒长度和生育力？
- 核心机制
- TEBP-1和TEBP-2通过其第三个预测的homeo-/myb结构域结合双链端粒重复序列，并通过C端尾部与POT-1的OB-fold直接相互作用；POT-1桥接双链结合模块与单链结合蛋白POT-2和MRT-1。
- 主要证据
- 定量蛋白质组学鉴定TEBP-1和TEBP-2；DNA下拉和荧光偏振证实其双链端粒结合；体内GFP共定位显示与POT-1共定位；tebp-1和tebp-2突变体端粒分别延长和缩短；双突变体合成不育；IP-qMS、Co-IP和Y2H证实复合体相互作用。
- 研究意义
- 提供了秀丽隐杆线虫端粒蛋白复合体组成和组织的见解，并表明TEBP-1和TEBP-2是生育力所必需的。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TEBP-1和TEBP-2的端粒DNA结合
确认R06A4.2和T12E12.3直接结合双链端粒DNA
用重组His标签蛋白进行DNA下拉，用内源标签株进行胚胎提取物下拉，用单链和双链探针区分结合类型，并用荧光偏振测定亲和力。
体内定位分析
检测TEBP-1和TEBP-2是否在体内定位于端粒
将endogenously tagged tebp-1::gfp和tebp-2::gfp与生殖系特异性pot-1::mCherry转基因株杂交，对胚胎、卵母细胞、精子和生殖系进行共聚焦成像。
端粒长度表型分析
确定tebp-1和tebp-2突变对端粒长度的影响
用CRISPR-Cas9生成缺失突变体，培养超过100代后进行端粒Southern blot，并对解剖的成年生殖系和胚胎进行定量FISH。
遗传相互作用与生育力分析
分析tebp-1和tebp-2双突变体的生育力和生殖系形态
杂交单突变体，计数F2/F3代育性，在20°C和25°C测量 brood size，用pgl-1::mTagRfp-T报告基因分类生殖系形态，并进行Mortal Germline试验。
端粒复合体生化鉴定
确定TEBP-1和TEBP-2是否与其他端粒蛋白形成复合体
对表达TEBP-1::3xFLAG; TEBP-2::GFP的胚胎提取物进行尺寸排阻色谱，用Sm核酸酶处理后再分析，并进行IP-qMS和Co-IP。
直接相互作用和结构域映射
鉴定TEBP-1、TEBP-2和POT-1之间的直接相互作用及负责区域
用酵母双杂交检测全长和片段蛋白相互作用，用His-MBP标签片段进行DNA下拉定位DNA结合域。
进化保守性分析
推断tebp基因在秀丽隐杆线虫属中的进化历史
通过双向BLASTP鉴定直系同源物，多序列比对构建系统发育树，分析局部共线性，并用C. briggsae核提取物进行端粒DNA下拉。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
鉴定端粒结合蛋白
分析端粒长度
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA下拉 | T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201 |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Scientific | EL0011 | |
| 生物素-7-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO | |
| Klenow片段exo-聚合酶 | Thermo Scientific | EP0422 | |
| MicroSpin Sephadex G-50柱 | GE Healthcare | GE27-5330-01 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1 | Thermo Scientific | 65001 | |
| 鲑鱼精DNA | Ambion | AM9680 | |
| 质谱样品制备 | NuPAGE LDS样品缓冲液 | Thermo Scientific | NP0008 |
| NuPAGE 10% Bis-Tris凝胶 | Thermo Scientific | NP0301 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | Thermo Scientific | NP0321 | |
| MOPS缓冲液 | Thermo Scientific | NP0001 | |
| Concentrator Plus浓缩仪 | Eppendorf | 5305000304 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T6567 | |
| TEAB缓冲液 | Fluka | 17902 | |
| 氘代甲醛 | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| 甲酸溶液 | Merck | 1.00264.1000 | |
| Empore C18材料 | 3M | 15334911 | |
| 质谱分析 | EASY-nLC 1000系统 | Thermo Scientific | -- |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 重组蛋白表达 | Rosetta 2 (DE3) pLysS感受态细胞 | Novagen | 71401 |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693132001 | |
| 氧化锆珠 | Carl Roth | N033.1 | |
| FastPrep-24 Classic匀浆仪 | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Branson Sonifier 450超声破碎仪 | Branson | -- | |
| ArcticExpress DE3细胞 | Agilent | 230192 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| 蛋白纯化 | HisTrap HP柱 | GE Healthcare | GE17-5247-01 |
| PD-10脱盐柱 | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| 荧光偏振 | Tecan Spark 20 M酶标仪 | Tecan | -- |
| 免疫沉淀 | GFP结合磁性琼脂糖珠 | Chromotek | gtma-20 |
| Dynabeads蛋白G磁珠 | Invitrogen | 10004D | |
| 单克隆抗FLAG M2抗体 | Sigma Aldrich | F3165 | |
| Western blot | Amersham Protran硝酸纤维素膜 | VWR | 10600002 |
| Whatman纸 | GE Healthcare-Whatman | WHA10426892 | |
| PentaHis试剂盒 | Qiagen | 34460 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 15626144 | |
| 抗GFP抗体 | Roche | 11814460001 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| HRP标记抗兔IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| IRDye 680RD驴抗小鼠IgG | LI-COR | 926-68072 | |
| IRDye 800CW驴抗兔IgG | LI-COR | 926-32213 | |
| 端粒Southern blot | HinfI限制酶 | New England BioLabs | R0155 |
| RsaI限制酶 | New England BioLabs | R0167 | |
| SYBR Safe DNA染料 | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| GeneRuler 1 kb分子量标准 | Thermo Scientific | SM0312 | |
| 1 kb扩展分子量标准 | New England BioLabs | N3239 | |
| Byodine B膜 | Pall | 60207 | |
| qFISH | PNA-FISH TTAGGC端粒探针 | Panagene | -- |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector laboratories | H-1200-10 | |
| 多聚赖氨酸包被载玻片 | Sigma Aldrich | P0425 | |
| 20号针头 | Sterican, Roth | C718.1 | |
| 尺寸排阻色谱 | Superose 6 10/300 GL柱 | GE Healthcare | 17517201 |
| Amicon Ultra 0.5 ml 10K离心过滤器 | Merck | UFC5010 | |
| Criterion TGX免染蛋白凝胶 | Bio-Rad | 5678085 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1620112 | |
| CRISPR-Cas9基因组编辑 | pCFJ104质粒 | Addgene | 19328 |
| pDD162质粒 | Addgene | 47549 | |
| p46169质粒 | Addgene | 46169 | |
| pDD282质粒 | Addgene | 66823 | |
| RNA提取 | TRIzol LS试剂 | Invitrogen | 10296010 |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus试剂盒 | Zymo Research | R2070 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 端粒DNA下拉定量蛋白质组学 | 核提取物来源为同步化妊娠成虫；LFQ为2生物学重复×4技术重复，DML为2技术重复并含标记互换；富集阈值>4倍 阅读提示：Methods中DNA pulldowns和Mass spectrometry部分，Fig. 1a,b图注 |
| TEBP-1/TEBP-2双链端粒结合验证 | 内源标签株为TEBP-1::3xFLAG和TEBP-2::GFP；使用5x(TTAGGC)双链和单链探针；荧光偏振蛋白浓度4 µM至4 nM，探针20 nM 阅读提示：Methods中In vitro single- or double-strand binding部分，Fig. 1c-h图注 |
| 端粒长度分析 | tebp-1(xf133)培养约98-102代，tebp-2(xf131)培养约120-124代；qFISH分析n=9-11只独立动物；Southern blot使用15 µg基因组DNA 阅读提示：Methods中Telomere Southern blot和Quantitative FISH部分，Fig. 3图注 |
| 合成不育和生殖系表型分析 | 使用tebp-1(xf133)和tebp-2(xf131)等位基因；brood size在20°C和25°C测定；生殖系分类在成年第2天进行；Mortal Germline试验每株n=15板 阅读提示：Methods中Fertility assays、Mortal germline assay和pgl-1::mTagRfp-T交叉部分，Fig. 4图注 |
| 端粒复合体相互作用鉴定 | IP-qMS每组4次重复；Sm核酸酶处理浓度0.05%；Y2H使用PJ69-4α菌株；尺寸排阻色谱使用Superose 6柱 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation、Yeast two-hybrid assay和Size-exclusion chromatography部分，Fig. 5和Fig. 6图注 |