MSC对前列腺癌细胞生长的体外效应
验证MSC是否直接影响前列腺癌细胞生长及是否诱导凋亡。
将PAIII等前列腺癌细胞与小鼠MSC直接共培养或用MSC条件培养基处理，检测生长和cleaved caspase-3。
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间充质干细胞来源的白细胞介素-28驱动对凋亡抵抗的骨转移性前列腺癌的选择
Mesenchymal stem cell-derived interleukin-28 drives the selection of apoptosis resistant bone metastatic prostate cancer.
实验完整度
高含体外细胞系、原代MSC共培养、小鼠胫骨内注射模型及患者骨转移样本IHC，并有IL-28中和、shRNA敲低、STAT3抑制等功能与机制验证
主要模型
PAIII大鼠前列腺癌细胞系 DU145人前列腺癌细胞系 小鼠骨髓来源MSC（CD29+SCA1+CD45Neg） Rag2−/−及NSG小鼠胫骨内注射模型
重点核对
MSC条件培养基浓度（50%）及处理时间（6 h、24 h、48 h、72 h） PAIII与MSC共培养比例（1:1至1:10）及接种密度（2×10^4/孔） 胫骨内注射细胞量（PAIII 2×10^4，DU145 5×10^5）及MSC 1:1比例 S3I-201剂量（5 mg/kg，隔日腹腔注射）及随机化时间（肿瘤建立3天后） IL-28中和抗体浓度（10 µg/ml）及重组IL-28浓度范围（0–128 ng/ml）
摘要
骨转移性前列腺癌（PCa）促进间充质干细胞（MSC）的募集及其向成骨细胞的分化。然而，骨髓来源MSC对PCa细胞的影响研究较少。在此，我们报道MSC来源的白细胞介素-28（IL-28）通过IL-28受体α（IL-28Rα）-STAT1信号触发前列腺癌细胞凋亡。然而，长期暴露于MSC驱动了对IL-28诱导的凋亡及多西他赛等治疗药物抵抗的前列腺癌细胞的选择。此外，MSC选择/IL-28抵抗的前列腺癌细胞在骨内以加速速率生长。获得性凋亡抵抗是PCa细胞内在的，并与IL-28Rα信号从STAT1向STAT3的转变相关。值得注意的是，STAT3敲除或抑制损害了MSC选择的前列腺癌细胞的生长和存活。因此，骨髓MSC驱动了治疗抵抗性骨转移性前列腺癌的出现，但可通过靶向STAT3来消除。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 骨髓来源MSC如何影响骨转移性前列腺癌细胞的存活、进展及治疗抵抗。
- 核心机制
- MSC来源IL-28经IL-28Rα-STAT1信号诱导前列腺癌细胞凋亡；长期暴露选择出凋亡抵抗细胞，其IL-28Rα信号由STAT1转向STAT3，STAT3活性维持其生长和存活。
- 主要证据
- 体外共培养和条件培养基实验显示MSC抑制PAIII生长并诱导cleaved caspase-3；IL-28中和或IL-28Rα敲低阻断凋亡；MSC选择的F2细胞对IL-28和多西他赛抵抗，伴STAT3活性升高；STAT3敲低或S3I-201抑制F2细胞体内外生长。
- 研究意义
- 作者提出骨髓MSC驱动治疗抵抗性骨转移性前列腺癌的出现，靶向STAT3或可消除该抵抗并可能使前列腺癌细胞对化疗重新敏感。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MSC在骨内对前列腺癌生长的影响
验证MSC对骨内前列腺癌生长的作用。
将 luciferase 标记的PAIII细胞单独或与小鼠MSC按1:1比例胫骨内注射，连续监测生物发光。
长期MSC暴露选择凋亡抵抗细胞
验证MSC是否选择出对凋亡和化疗抵抗的前列腺癌细胞亚群。
将PAIII和DU145暴露于50% MSC CM 72 h，存活克隆扩增为F1，再经一轮选择为F2，检测生长、凋亡和对多西他赛的IC50。
鉴定MSC来源凋亡因子为IL-28
确定MSC CM中诱导前列腺癌细胞凋亡的因子。
对MSC CM进行热灭活或蛋白酶K处理，细胞因子阵列，IL-28中和抗体及IL-28Rα shRNA敲低。
STAT1向STAT3信号转变的验证
验证MSC选择的抵抗细胞是否发生IL-28Rα下游STAT1向STAT3的信号转变。
检测F0和F2细胞在MSC CM刺激下STAT1、STAT3总蛋白和磷酸化水平及DNA结合活性，并用siRNA敲低STAT3。
STAT3抑制对MSC选择细胞的体内外效应
验证靶向STAT3能否抑制MSC选择的凋亡抵抗前列腺癌细胞生长。
用ruxolitinib或S3I-201处理F0和F2细胞，并将F0/F2 DU145胫骨内注射后随机给予S3I-201或溶剂对照。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | II型胶原酶 | Invitrogen | -- |
| α-MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96细胞活力检测试剂盒 | Pierce | G3582 |
| 生物发光检测 | Promega荧光素酶检测系统 | Promega | E1500 |
| IL-28中和 | IL-28中和抗体 | R&D | AF1789 |
| 正常山羊IgG | R&D | AB108C | |
| 重组蛋白处理 | 重组IL-28 | R&D | 1789-ML |
| 免疫荧光 | 泛细胞角蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | C2562 |
| 磷酸化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling | 9701L | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling | 9661S | |
| α平滑肌肌动蛋白（1A4）抗体 | Cell Signaling | 48938 | |
| IL-28Rα抗体 | Bioss | ABIN1387718 | |
| pSTAT3 Tyr705（D3A7）抗体 | Cell Signaling | 9145 | |
| CD90/Thy1 [EPR3132]抗体 | abcam | ab92574 | |
| 小鼠/大鼠Nestin抗体 | R&D | MAB2636 | |
| Alexa Fluor山羊抗兔568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Alexa Fluor山羊抗小鼠488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| 含DAPI的Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 体外免疫荧光 | 8孔腔室载玻片 | LAB-TEK | 154534 |
| Alexa Fluor山羊抗兔488 | Invitrogen | A-11034 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂 | Pierce | 23225 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661S | |
| pSTAT1 Tyr701抗体 | Cell Signaling Technology | 7649S | |
| pSTAT1 Ser727抗体 | Cell Signaling Technology | 9177 | |
| pSTAT3 Tyr705（D3A7）抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| STAT3（D3Z26）抗体 | Cell Signaling Technology | 12640S | |
| STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9172S | |
| pJAK2 Y1007/1008抗体 | Cell Signaling Technology | 3776S | |
| IL-10Rβ抗体 | Santa Cruz | sc271969 | |
| IL-28Rα抗体 | Abcam | ab83865 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-1615 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 3700 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 细胞因子阵列 | Ray Biotech小鼠细胞因子阵列C-2000 | Ray Biotech | AAM-CYT-2000 |
| STAT活性检测 | STAT1/3 DNA结合活性实验裂解缓冲液 | Active Motif | 40010 |
| STAT1/3 DNA结合活性实验 | Active Motif | 42296 | |
| RNA提取与逆转录 | TRIzol | Invitrogen | 15596 |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 | |
| PCR | HotStarTaq预混液 | Qiagen | 203445 |
| shRNA敲低 | 人IL-28Rα shRNA | Origene | HT144125A-D |
| 大鼠IL-28Rα shRNA | Origene | HT144126A-D | |
| 乱序对照shRNA | Origene | TR30033 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778500 |
| 大鼠STAT3 siRNA | Origene | SR501698A-C | |
| 人STAT3 siRNA | Origene | SR321907A-C | |
| 对照siRNA | Origene | SR2004 | |
| 支原体检测 | 支原体检测试剂盒 | R&D Systems | CUL001B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MSC条件培养基处理与共培养 | MSC CM浓度50%、处理时间6–72 h、PAIII:MSC共培养比例1:1至1:10、接种密度2×10^4/孔 阅读提示：Methods 'Cell lines, culture, and animals'及Fig. 1、Fig. 3图注 |
| 胫骨内肿瘤模型 | PAIII 2×10^4/只、DU145 5×10^5/只、MSC 1:1比例、Rag2−/−或NSG小鼠、生物发光监测频率 阅读提示：Methods 'Intratibial tumor studies'及Fig. 2、Fig. 4图注 |
| IL-28中和与重组IL-28处理 | 中和抗体10 µg/ml、重组IL-28 0–128 ng/ml、处理48 h、IL-28Rα shRNA序列 阅读提示：Methods 'Cell line conditioned media collection and treatment'及Fig. 5图注 |
| STAT3抑制体内实验 | S3I-201 5 mg/kg隔日腹腔注射、肿瘤建立3天后随机化、每组n=10 阅读提示：Methods 'Intratibial tumor studies'及Fig. 7图注 |
| 化疗药物敏感性检测 | 多西他赛0–6.25 nM处理48 h、依托泊苷50 µM、MTT检测490 nm 阅读提示：Methods 'Cell line conditioned media collection and treatment'及Fig. 3图注 |