单细胞转录组测序与细胞类型鉴定
构建膀胱尿路上皮癌及癌旁组织的肿瘤微环境细胞图谱
对8例肿瘤和3例癌旁样本制备单细胞悬液，基于液滴法进行scRNA-seq，质控后对52721个单细胞聚类并用经典标志基因注释细胞类型
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
单细胞RNA测序揭示炎性癌相关成纤维细胞在膀胱尿路上皮癌中的作用
Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma.
实验完整度
高scRNA-seq、InferCNV、免疫荧光、流式验证、共培养集落形成及TCGA/GEO大队列生存分析多层级验证
主要模型
8例膀胱尿路上皮癌原发肿瘤组织 3例癌旁正常黏膜组织 T24和EJ膀胱尿路上皮癌细胞系 TCGA BLCA队列及GEO/ArrayExpress公共队列
重点核对
8例原发膀胱肿瘤（2例低级别、6例高级别）及3例癌旁正常黏膜样本 iCAFs分选策略为CD31-CD45lowPDGFRA+，与膀胱癌细胞共培养 共培养集落形成实验：膀胱癌细胞2×10^3接种下室，iCAFs 1×10^5接种上室，共培养7天，n=5 免疫荧光组织芯片含30对配对肿瘤与癌旁样本，n=30 CIBERSORTx评估TCGA BLCA及基于微阵列的meta队列中细胞类型丰度并做生存分析
摘要
尽管癌症生物学和治疗已取得重大进展，膀胱癌（BC）患者的临床结局仍不理想。肿瘤微环境（TME）是一个潜在靶点。本研究对8例BC肿瘤样本和3例癌旁样本进行单细胞RNA测序，在BC微环境中鉴定出19种不同细胞类型，显示高度的瘤内异质性。我们发现肿瘤细胞下调MHC-II分子，提示癌细胞免疫原性降低可能促进免疫抑制微环境的形成。我们还发现单核细胞在肿瘤区域发生M2极化并分化。此外，LAMP3+ DC亚群可能能够募集调节性T细胞，从而可能参与免疫抑制性TME的形成。通过对包含3000多例BC样本的公共数据集进行相关性分析，我们鉴定出炎性癌相关成纤维细胞（iCAFs）在肿瘤进展中的作用，其与不良预后显著相关。此外，我们刻画了一个依赖iCAFs的调控网络。这些结果有助于阐明iCAFs的促肿瘤机制。我们的结果为癌症免疫学提供了深入见解，并为未来的药物发现提供了重要资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 膀胱尿路上皮癌肿瘤微环境由哪些细胞类型组成，其中哪些细胞亚群在肿瘤进展和免疫抑制微环境形成中起关键作用。
- 核心机制
- 肿瘤细胞下调MHC-II分子降低免疫原性，单核细胞经M2极化分化为TAMs，LAMP3+ DCs通过CCL17/CCL22招募CCR4+ Tregs，iCAFs分泌CXCL12及IGF1等生长因子构建促肿瘤调控网络。
- 主要证据
- 对8例肿瘤和3例癌旁样本共52721个单细胞进行scRNA-seq鉴定19种细胞类型；免疫荧光验证MHC-II下调和iCAFs/mCAFs分布；流式分选iCAFs与膀胱癌细胞共培养显示促增殖；TCGA及3000余例公共队列显示iCAFs与不良预后相关。
- 研究意义
- 研究为癌症免疫学提供深入见解，并为未来药物发现提供重要资源；提示靶向CAFs可能是膀胱癌治疗的潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
癌细胞拷贝数变异与免疫原性分析
区分恶性与非恶性上皮细胞并评估癌细胞免疫原性变化
对EPCAM+上皮细胞再聚类，用InferCNV检测CNV并按CNV将EPC分为低、高、对照和未检出四组，比较转录组、GO富集、GSVA通路活性并用免疫荧光验证MHC-II表达
髓系细胞亚群与单核细胞向TAM分化分析
解析髓系细胞异质性及单核细胞向TAM的M2极化过程
对LYZ+髓系细胞再聚类，用流式验证亚群，采用Monocle2轨迹分析和RNA velocity分析单核细胞向TAM分化，SCENIC分析转录因子motif活性
成纤维细胞亚群鉴定与功能分析
鉴定iCAFs和mCAFs亚群并评估其功能及临床相关性
对COL1A1+成纤维细胞再聚类为PDGFRA+ iCAFs和RGS5+ mCAFs，进行GO、GSEA和SCENIC分析，免疫荧光验证亚群及CXCL12表达，并在TCGA BLCA队列做相关性及生存分析
iCAFs促增殖功能体外验证
验证iCAFs对膀胱癌细胞增殖的促进作用
流式分选CD31-CD45lowPDGFRA+ iCAFs，与T24和EJ膀胱癌细胞系进行transwell共培养集落形成实验
细胞通讯网络构建与公共数据集验证
预测以iCAFs为中心的配体-受体调控网络并评估细胞类型的临床意义
用CellPhoneDB2分析细胞间通讯，用CIBERSORTx评估TCGA及meta队列中各细胞类型丰度并进行生存分析和分子亚型关联分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞悬液制备 | 胰蛋白酶 | Gibco | R001100 |
| II型胶原酶 | Biofrox | 2275MG100 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Servicebio | 1121MG010 | |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3′试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞控制器 | 10x Genomics | -- | |
| DynaBeads Myone硅烷磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HiSeq X Ten测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 抗HLA-DRA抗体 | Proteintech | 11221-1-AP |
| 抗EPCAM抗体 | Proteintech | 21050-1-AP | |
| 抗RGS5抗体 | Proteintech | 11590-1-AP | |
| 抗PDGFRA抗体 | Abcam | ab203491 | |
| 抗CXCL12抗体 | Abcam | ab155090 | |
| 流式分析 | 抗CD31抗体 | BD | 566563 |
| 抗CD45抗体 | BD | 555482 | |
| 抗PDGFRA抗体 | BD | 562799 | |
| 抗CD3抗体 | BD | 555335 | |
| 抗CD14抗体 | BD | 563079 | |
| 抗CCR7抗体 | BD | 557734 | |
| 抗CLEC9A抗体 | BD | 564266 | |
| 抗CD1c抗体 | BD | 564900 | |
| 共培养集落形成 | Transwell小室 | Corning Incorporated | -- |
| 结晶紫 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本来源与队列构成 | 8例原发膀胱肿瘤（2例低级别、6例高级别）及3例癌旁正常黏膜；伦理批号IRB S116 阅读提示：Methods 的 Patients and samples 小节 |
| 单细胞测序质控与整合 | UMI≥1000、线粒体UMI≤10%、检测基因数≤6000的过滤阈值；top 3000可变基因整合；top 30 PCs；res=0.8 阅读提示：Methods 的 Raw data processing and quality control 小节 |
| iCAFs分选与共培养 | 分选表型CD31-CD45lowPDGFRA+；膀胱癌细胞2×10^3、iCAFs 1×10^5、0.4 µm孔径、共培养7天、n=5 阅读提示：Methods 的 Flow cytometry experiments 与 Co-culture colony formation experiments 小节及 Fig. 4f, g 图注 |
| 免疫荧光验证 | 组织芯片HBla-U060CS-01含30对配对样本；各抗体稀释比例及货号 阅读提示：Methods 的 Immunofluorescence staining 小节及 Fig. 1g、Fig. 3c, j 图注 |
| 公共队列生存分析 | TCGA BLCA及GEO/ArrayExpress meta队列；CIBERSORTx默认参数；细胞丰度按高低50%分组；Log-rank p<0.05 阅读提示：Methods 的 Correlation to public datasets 小节及 Fig. 5 图注 |