TAGAP在巨噬细胞抗真菌信号中的功能验证
验证TAGAP是否参与Dectin-1等受体介导的抗真菌信号激活和促炎因子产生。
使用TAGAP缺陷小鼠BMDMs和TAGAP敲低THP-1细胞，经Curdlan、热灭活白念珠菌、D-zymosan、α-mannan或TDB刺激，检测NF-κB/MAPK磷酸化及促炎基因表达。
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TAGAP通过桥接Dectin激活与EPHB2信号指导Th17分化以参与先天抗真菌免疫应答
TAGAP instructs Th17 differentiation by bridging Dectin activation to EPHB2 signaling in innate antifungal response.
实验完整度
高含BMDMs、THP-1、293T、DCs、TAGAP-KO小鼠、白念珠菌感染及EAE模型，涵盖信号通路、基因敲除、回补、免疫共沉淀、体内功能验证等多层次证据。
主要模型
TAGAP缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） THP-1细胞系（CRISPR敲除或敲低） TAGAP缺陷小鼠（白念珠菌感染模型） TAGAP缺陷小鼠（MOG35–55诱导EAE模型）
重点核对
BMDMs经Curdlan（100 μg/ml）、热灭活白念珠菌（MOI=2）或D-zymosan（100 μg/ml）刺激后的NF-κB和MAPK信号激活及促炎基因表达 TAGAP Y310位点磷酸化依赖EPHB2，且Y310F突变体丧失与CARD9结合及膜定位 TAGAP缺陷小鼠感染白念珠菌后的生存率、体重丢失、肝/肾真菌负荷及淋巴结Th17比例 TAGAP缺陷小鼠EAE临床评分、脊髓炎症浸润和脱髓鞘程度 Dasatinib（0.3 μM）和Vandetanib（2 μM）预处理对Dectin配体诱导促炎基因表达的抑制
摘要
TAGAP基因位点已被发现与多种感染性疾病或自身免疫性疾病相关，包括念珠菌血症和多发性硬化。虽然先前研究描述了TAGAP在T细胞中的作用，但对其在其他细胞类型中的功能知之甚少。在此我们报道，TAGAP是髓系细胞中Dectin诱导的抗真菌信号和促炎细胞因子产生所必需的。在Dectin配体刺激后，TAGAP被EPHB2在酪氨酸310位点磷酸化，从而将Dectin诱导的近端EPHB2活性与下游CARD9介导的信号通路桥接。在白念珠菌感染期间，缺少TAGAP的小鼠产生缺陷的免疫应答、受损的Th17细胞分化以及更高的真菌负荷。类似地，在多发性硬化的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，TAGAP缺陷小鼠发生显著减轻的疾病。总之，我们报道TAGAP在将Dectin诱导的信号与促进有效T辅助细胞免疫应答联系起来方面发挥重要作用，这发生在抗真菌宿主防御和自身免疫中。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TAGAP在髓系细胞抗真菌免疫应答中的功能及其与Th17分化、自身免疫疾病易感性的关系是什么？
- 核心机制
- Dectin配体激活Syk，Syk磷酸化EPHB2，EPHB2在Y310位点磷酸化TAGAP，磷酸化TAGAP招募CARD9以激活下游NF-κB和MAPK信号，促进IL-23a、IL-12a等促炎因子分泌，进而驱动Th17和Th1分化。
- 主要证据
- BMDMs、DCs和THP-1细胞中TAGAP缺失或敲低导致Dectin配体诱导的NF-κB/MAPK激活和促炎基因表达降低；TAGAP缺陷小鼠在白念珠菌感染后Th17细胞减少、真菌负荷升高、生存率下降，在EAE模型中疾病减轻；人PBMC中TAGAP mRNA水平与Th17丰度正相关。
- 研究意义
- 揭示了TAGAP基因多态性增加自身免疫和感染性疾病易感性的机制，将抗真菌信号通路与自身免疫疾病易感性联系起来，并为Th17介导的自身免疫疾病提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TAGAP与EPHB2及Dectin受体的相互作用鉴定
确定TAGAP如何被招募至Dectin受体复合物。
免疫共沉淀和质谱鉴定TAGAP结合蛋白；在HEK293T细胞中共转染TAGAP、TAGAPΔGAP、EPHB2及各结构域突变体，分析相互作用；在EPHB2敲低的293T细胞中检测TAGAP与Dectin-1/2的相互作用。
EPHB2对TAGAP Y310位点的磷酸化及CARD9招募
验证EPHB2激酶是否磷酸化TAGAP并介导CARD9结合。
体外激酶实验检测Syk对EPHB2的磷酸化；共转染EPHB2与TAGAP野生型或Y310F突变体，检测磷酸化；免疫共沉淀和免疫荧光检测TAGAP与CARD9结合及共定位。
TAGAP缺陷小鼠的T辅助细胞分化分析
明确TAGAP在体内T细胞分化中的作用及是否通过先天免疫细胞间接影响Th17/Th1极化。
流式细胞术检测TAGAP缺陷小鼠淋巴结和脾脏中Th17和Th1比例；MOG35–55免疫及再刺激后检测T细胞极化；将TAGAP缺陷DCs与野生型CD4+ T细胞共培养，检测Th17分化。
TAGAP缺陷小鼠的抗真菌感染和EAE模型验证
评估TAGAP在体内抗真菌防御和自身免疫疾病模型中的作用。
白念珠菌感染后监测生存率、体重丢失、肝/肾真菌负荷和淋巴结Th17比例；MOG35–55诱导EAE，评估临床评分、脊髓炎症浸润和脱髓鞘。
Dasatinib和Vandetanib对EAE的干预
测试广谱酪氨酸激酶抑制剂对Th17/Th1分化和EAE严重程度的影响。
体外检测Dasatinib和Vandetanib对EPHB2介导TAGAP磷酸化的抑制；BMDMs预处理后检测Dectin配体诱导的基因表达；EAE小鼠口服给药2周，评估临床评分和脑/脾Th17、Th1比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ficoll-paque PREMIUM密度梯度离心液 | GE Healthcare | 17-5442-02 |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-4 | Peprotech | -- | |
| 刺激处理 | 可得然胶 | Invivogen | tlrl-cud |
| D-酵母聚糖 | Invivogen | tlrl-zyd | |
| 酵母聚糖 | Invivogen | tlrl-zyn | |
| α-甘露聚糖 | Sigma | M3640 | |
| Western blot | 抗磷酸化IκBα抗体(14D4) | Cell Signaling Technology | 2859 |
| 抗磷酸化p65抗体(93H1) | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗磷酸化p38抗体(D3F9) | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗磷酸化JNK抗体(81E11) | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗磷酸化Raf-1抗体(56A6) | Cell Signaling Technology | 9427 | |
| 抗磷酸化SYK抗体(C87C1) | Cell Signaling Technology | 2710 | |
| 抗HA标签抗体(C29F4) | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗Flag标签抗体(D6W5B) | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 免疫共沉淀 | 抗HA抗体(H9658) | Sigma | H9658 |
| 抗Flag抗体(F1804) | Sigma | F1804 | |
| Western blot | 抗磷酸化ERK抗体(12D4) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-81492 |
| 抗磷酸化酪氨酸抗体(PY20) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-508 | |
| 抗EPHB2抗体(2D12C6) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-130068 | |
| 抗HSP90抗体(AC-16) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-101494 | |
| 抗肌动蛋白抗体(C-2) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-8432 | |
| 抗CARD9抗体(A-8) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-374569 | |
| 抗GAPDH抗体(2E3-2E10) | SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-293335 | |
| 抗Syk抗体 | Abclonal | A2123 | |
| 抗磷酸化EPHB2抗体(T594, T604) | Thermo Fisher | PA5-38480 | |
| 抗TAGAP抗体[EPR15593] | Abcam | ab187664 | |
| 流式细胞术 | 抗CD4抗体(GK1.5) | BioLegend | 100406 |
| 抗CD8抗体(53-6.7) | BioLegend | 100758 | |
| 抗F4/80抗体(BM8) | BioLegend | 123116 | |
| 抗Ly6G抗体(1A8) | BioLegend | 127606 | |
| 抗B220抗体(RA3-6B2) | BioLegend | 103212 | |
| 抗CD11C抗体(N418) | BioLegend | 117324 | |
| 抗IL-17A抗体(TC11-18H10.1) | BioLegend | 506908 | |
| 抗CD3抗体(17A2) | BioLegend | 100204 | |
| 抗CD44抗体(IM7) | BioLegend | 103010 | |
| 抗CD62L抗体(MEL-14) | BioLegend | 104412 | |
| 抗CD21抗体(7E9) | BioLegend | 123418 | |
| 抗CD23抗体(B3B4) | BioLegend | 101608 | |
| 抗IgM抗体(RMM-1) | BioLegend | 406506 | |
| 抗IgD抗体(11-26c.2a) | BioLegend | 405736 | |
| 抗IFN-γ抗体(XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| 组织染色 | 卢卡斯快蓝MBS溶液 | Electron Microscopy Sciences | 26681 |
| 免疫 | 完全弗氏佐剂 | Difco | -- |
| 百日咳毒素 | Sigma | -- | |
| 细胞分选 | 初始CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-453 |
| 转染 | GenMute转染试剂 | SignaGen Company | -- |
| PepMute转染试剂 | SignaGen Company | -- | |
| 药物处理 | 达沙替尼 | MCE | HY-10181 |
| 凡德他尼 | MCE | HY-10260B | |
| 免疫 | MOG35–55肽段 | R&D systems | 2568 |
| 细胞因子 | 转化生长因子-β | Peprotech | -- |
| 白细胞介素-6 | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-12a | Peprotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDMs和BMDCs分化 | M-CSF 20 ng/ml培养5–7天（BMDMs）；GM-CSF 20 ng/ml和IL-4 10 ng/ml培养9天（BMDCs）；小鼠年龄6–8周 阅读提示：Methods - Mouse BMDMs and BMDCs preparation |
| Dectin配体刺激 | Curdlan 100 μg/ml；热灭活白念珠菌sc-5314 MOI=2；D-zymosan 100 μg/ml；α-mannan 100 μg/ml；TDB 50 μg/well；刺激时间点（如图注所示） 阅读提示：图1、图2、图3图注及Methods - Reagents |
| TAGAP Y310磷酸化检测 | HEK293T共转染EPHB2与TAGAP野生型或Y310F；抗HA免疫沉淀后抗磷酸化酪氨酸印迹；热灭活白念珠菌MOI=2刺激THP-1 阅读提示：图4e、4f图注及Methods - Tyrosine phosphorylation detection |
| 白念珠菌感染模型 | 尾静脉注射活菌5×10^5（生存）或2×10^5（真菌负荷和Th17）；感染后7天检测真菌负荷和淋巴结Th17；器官匀浆铺板计数CFU 阅读提示：图6图注及Methods - C. albicans infection |
| EAE模型 | MOG35–55 200 μg + H37RA 400 μg皮下免疫；第0、3、7天腹腔注射百日咳毒素0.2 μg；每日 blinded 评分；Dasatinib/Vandetanib 20 mg/kg/天口服灌胃2周 阅读提示：图8图注及Methods - Induction and assessment of EAE |
| 体外Th17/Th1分化 | naive CD4+ T细胞用抗CD3 1 μg/mL和抗CD28 1 μg/mL激活；Th17条件：TGF-β 2 ng/mL、IL-6 20 ng/mL、抗IL-4 5 μg/mL、抗IFN-γ 5 μg/mL；Th1条件：IL-12a 20 ng/mL、抗IL-4 5 μg/mL；培养3–5天 阅读提示：Methods - In vitro naive CD4+ T-cell differentiation及图5e图注 |
| 人PBMC刺激 | PBMC 1×10^6 cells/ml，Curdlan 100 μg/ml或α-mannan 100 μg/ml刺激3 h；TAGAP SNP基因型分组 阅读提示：Methods - Human PBMC study及图7图注 |