mito-SEP预测与筛选
从人SEP肽组中鉴定定位于线粒体的SEP
基于核糖体图谱数据筛选2343个高质量人SEP，通过线粒体基因表达特征、线粒体靶向结构域预测和线粒体质谱数据检测三种策略预测mito-SEP，并用HA免疫荧光验证线粒体定位。
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线粒体肽BRAWNIN对脊椎动物呼吸链复合体III的组装至关重要
Mitochondrial peptide BRAWNIN is essential for vertebrate respiratory complex III assembly.
实验完整度
高涵盖细胞系、小鼠MEF、斑马鱼敲除模型及患者组织样本，并进行功能、机制和体内验证
主要模型
U87MG胶质母细胞瘤细胞系 HEK293T和HeLa细胞系 斑马鱼br基因敲除模型 小鼠MEF细胞
重点核对
斑马鱼br敲除导致CIII亚基蛋白和组装CIII2显著减少，CIII活性下降 U87MG细胞中BR敲低降低基础、最大呼吸和ATP产生 BR与CIII组分UQCRC1和UQCRQ的共免疫沉淀验证 AICAR处理和饥饿诱导BR蛋白水平升高，伴随AMPK激活 斑马鱼mzKO幼虫乳酸和琥珀酸水平升高
摘要
小开放阅读框（sORF）编码肽（SEP）的出现正在迅速扩展已知蛋白组中较小尺寸的一端。在本研究中，我们展示线粒体蛋白组，尤其是呼吸链，富含小蛋白。通过使用SEP的预测与验证流程，我们报告发现了16种内源性核编码、定位于线粒体的SEP（mito-SEP）。通过功能预测、蛋白质组学、代谢组学和代谢通量建模，我们证明由C12orf73编码的71个氨基酸的肽BRAWNIN对呼吸链复合体III（CIII）组装至关重要。在人细胞中，BRAWNIN受能量感应AMPK通路诱导，其缺失会损害线粒体ATP产生。在斑马鱼中，Brawnin缺失导致完全CIII丢失，造成严重生长迟缓、乳酸酸中毒和早期死亡。我们的发现表明BRAWNIN对脊椎动物氧化磷酸化至关重要。我们提出mito-SEP是氧化代谢关键调控因子的未开发资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 线粒体蛋白组是否富含SEP，以及这些mito-SEP是否在线粒体功能中发挥重要作用？
- 核心机制
- BRAWNIN是位于线粒体内膜的肽，受AMPK-PGC-1α能量稳态轴调控，通过直接与CIII组分相互作用，在CIII生物发生早期促进CIII组装和/或稳定性，从而维持氧化磷酸化和ATP产生。
- 主要证据
- 在U87MG细胞中敲低BR降低呼吸和ATP产生；在斑马鱼br敲除中观察到CIII亚基蛋白和组装CIII2减少、CIII活性下降，以及乳酸和琥珀酸积累；BR与UQCRC1和UQCRQ的共免疫沉淀证实相互作用。
- 研究意义
- BRAWNIN是脊椎动物氧化磷酸化所必需的，mito-SEP是氧化代谢关键调控因子的未开发资源；br KO斑马鱼表型与CIII缺陷型线粒体病相似，为筛查线粒体疾病致病突变提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BRAWNIN功能预测与能量应激调控验证
探究BR表达是否受能量状态调控及其对细胞生物能量学的影响
用AICAR激活AMPK或进行葡萄糖、血清、脂肪酸饥饿处理HEK293T细胞，检测BR蛋白水平；在U87MG细胞中用siRNA和shRNA敲低BR，进行Seahorse线粒体应激测试。
斑马鱼br敲除与体内表型分析
在体内验证BR对脊椎动物生理和线粒体功能的要求
用Crispr/Cas9生成br敲除斑马鱼，观察生长、运动、存活，并分离骨骼肌线粒体进行呼吸分析。
代谢组学与代谢通量建模
确定br KO线粒体缺陷的分子基础
对5 dpf mzKO幼虫进行靶向代谢组学分析，并使用MitoCore代谢通量模型模拟阻断各反应对乳酸和琥珀酸输出的影响。
BR相互作用组与CIII组装验证
验证BR与CIII的物理相互作用及其对CIII组装和活性的要求
通过共免疫沉淀/质谱鉴定BR相互作用蛋白，用co-IP/ western blot验证；在br KO斑马鱼骨骼肌线粒体中进行定量蛋白质组学、BN-PAGE和呼吸链酶活性测定。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖Dulbecco改良Eagle培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | FuGENE转染试剂 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | 线粒体红色荧光探针 | -- | -- |
| 抗BR抗体 | Novus | NBP1-90536 | |
| 抗HA抗体 | BioLegend | 901502 | |
| 抗柠檬酸合酶抗体 | Santa Cruz | SC-390693 | |
| 抗TOMM20抗体 | Proteintech | 11802-1-AP | |
| Western blot | 抗肌动蛋白抗体 | Sigma | A2228 |
| 抗ATP5A抗体 | Santa Cruz | SC-136178 | |
| 抗TOMM70抗体 | AbClonal | A4349 | |
| 抗VDAC1抗体 | AbClonal | A0810 | |
| 抗MTCOI抗体 | Abcam | ab14705 | |
| 抗TIM23抗体 | Proteintech | 11123-1-AP | |
| 抗OXPHOS混合抗体 | Invitrogen | 45-7999 | |
| 抗UQCRC1抗体 | AbClonal | A3339 | |
| 抗NDUFA9抗体 | AbClonal | A3196 | |
| 抗SDHA抗体 | AbClonal | A2594 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma | T9822 | |
| 抗ACC抗体 | CST | 3662S | |
| 抗磷酸化ACC抗体 | CST | 3661S | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | 2118S | |
| 抗FLAG抗体 | BioLegend | 637302 | |
| 抗COX4抗体 | AbClonal | A10098 | |
| 抗UQCRC2抗体 | Abclonal | A4181 | |
| 抗UQCRFS1抗体 | Abcam | Ab14746 | |
| 抗UQCRH抗体 | Abcam | ab134949 | |
| 抗UQCRB抗体 | Sigma | HPA043060 | |
| 抗MTCYB抗体 | Proteintech | 55090-1-AP | |
| 抗AMPK抗体 | Bio-Rad | VMA00246 | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | CST | 2535 | |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | Abcam | ab110168 |
| 代谢组学 | 乙氧胺 | Sigma Aldrich | -- |
| Seahorse分析 | XF96e球形微孔板 | Agilent | -- |
| XF96细胞培养微孔板 | Agilent | -- | |
| XFe96传感器 cartridge | Agilent | -- | |
| 寡霉素 | Sigma | -- | |
| 羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙 | Sigma | -- | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma | -- | |
| 柠檬酸合酶测定 | DTNB | Sigma | -- |
| 乙酰辅酶A | Sigma | -- | |
| 草酰乙酸 | Sigma | -- | |
| 蛋白免疫印迹 | PVDF膜 | Thermo Fisher | -- |
| NuPAGE MES SDS电泳缓冲液 | Thermo Fisher | -- | |
| 蓝原生PAGE | Native-PAGE 3–12% Bis-Tris蛋白凝胶 | Thermo Fisher | -- |
| G-250样品添加剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 质谱 | 6 plex串联质谱标签 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Orbitrap Lumos质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Acclaim Pepmap纳升捕获柱 | Dionex | C18, 100, 75 μm × 2 cm | |
| Acclaim Pepmap RSLC分析柱 | Dionex | C18, 100, 75 μm × 50 cm | |
| 共免疫沉淀 | 抗FLAG M2树脂 | Sigma | -- |
| 3XFLAG肽 | Sigma | -- | |
| 斑马鱼实验 | MEGAshortscript T7试剂盒 | Invitrogen | AM1354 |
| HotStart Taq聚合酶 | Qiagen | -- | |
| 细胞培养 | 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- |
| 0.05%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| mito-SEP筛选与验证 | 候选SEP数量、转染细胞系、HA标签位置、免疫荧光验证标准 阅读提示：Methods的“sORF selection criteria”和“SEP transient over-expression”小节；Fig. 1e图注 |
| BR敲低与呼吸功能测定 | U87MG细胞系、siRNA/shRNA序列、转染浓度、Seahorse MitoStress测试药物浓度 阅读提示：Methods的“Brawnin knockdown”和“Seahorse cultured cell MitoStress test”小节；Fig. 3d–f图注 |
| 斑马鱼br敲除与表型分析 | gRNA序列、Cas9注射量、敲除品系、饲养密度、生长测量时间点 阅读提示：Methods的“Zebrafish Br knockout generation”和“Zebrafish husbandry and growth tracking”小节；Fig. 4图注 |
| BR相互作用组分析 | IP抗体、去污剂类型和浓度、过表达标签、质谱鉴定标准 阅读提示：Methods的“BR interactome analysis”和“BR co-IP with complex III”小节；Fig. 5d–f图注 |
| CIII组装和活性测定 | BN-PAGE digitonin比例、线粒体蛋白上样量、呼吸链酶活性测定方法 阅读提示：Methods的“Blue-native PAGE analysis”和“Respiratory chain enzymatic assays”小节；Fig. 6f, g图注 |