构建ZFP161敲除细胞并检测DNA损伤敏感性
验证ZFP161是否参与复制应激反应
用CRISPR/Cas9构建ZFP161敲除HCT116细胞，并以克隆形成实验检测对HU、CPT、UV、5-FU、IR、顺铂和olaparib的敏感性
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ZFP161通过招募ATR/ATRIP复合物调控复制叉稳定性并维持基因组稳定性
ZFP161 regulates replication fork stability and maintenance of genomic stability by recruiting the ATR/ATRIP complex.
实验完整度
高含CRISPR敲除细胞系、体外蛋白纯化结合实验、iPOND、DNA纤维、小鼠模型及TCGA队列分析
主要模型
HCT116细胞 U2OS细胞 HEK293T细胞 ZFP161敲除小鼠 TCGA结直肠癌数据
重点核对
HCT116细胞经CRISPR/Cas9构建ZFP161敲除克隆并以测序验证移码 10 mM HU处理2小时后检测RPA32 S4/8、S33和Chk1 S345磷酸化 ZFP161 T2（氨基酸291–316）结合RPA32，D3（缺失141–210）结合ATRIP iPOND使用10 µM EdU标记20分钟、4 mM HU处理2小时 ZFP161−/−小鼠每基因型3只、每只50个中期分裂相
摘要
DNA复制应激介导的ATR激酶通路激活对维持基因组稳定性具有重要作用。本研究中，我们鉴定了一个锌指蛋白ZFP161，其作为复制应激反应因子参与ATR激活。机制上，ZFP161作为支架蛋白促进RPA与ATR/ATRIP之间的相互作用。ZFP161通过不同区域分别结合RPA和ATR/ATRIP，并在停滞的复制叉处稳定RPA–ATR–ATRIP复合物。ZFP161的这一功能对ATR信号级联和基因组稳定性维持具有重要意义。此外，ZFP161敲除小鼠表现出ATR激活缺陷和基因组不稳定性。并且，ZFP161低表达与更高的癌症风险和染色体不稳定性相关。总体而言，这些发现提示ZFP161协调ATR/Chk1通路激活并有助于维持基因组稳定性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZFP161是否参与DNA复制应激反应，以及其如何调控ATR/ATRIP的招募与激活以维持基因组稳定性。
- 核心机制
- ZFP161作为支架蛋白，通过不同区域分别结合RPA和ATR/ATRIP，稳定RPA–ATR–ATRIP复合物，促进ATR/ATRIP在停滞复制叉处的招募和ATR-Chk1信号级联的完全激活。
- 主要证据
- ZFP161敲除细胞对HU、CPT、UV和5-FU敏感，ATR依赖的RPA32和Chk1磷酸化降低，ATR/ATRIP染色质结合和复制叉招募减少；DNA纤维实验显示复制叉重启缺陷；ZFP161−/−小鼠ATR激活受损并出现γ-H2AX增加、染色体不稳定和微核增多；TCGA分析显示ZFP161低表达与染色体不稳定相关。
- 研究意义
- 研究提示ZFP161是复制应激反应级联中ATR激活的调控因子，为理解ATR信号通路及基因组稳定性维持提供了新的机制环节。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测ZFP161在DNA损伤位点的定位
确认ZFP161是否定位于复制相关DNA损伤位点
HU或UV微辐照后，用免疫荧光检测ZFP161与phospho-RPA32（S4/8）及γ-H2AX共定位
验证ZFP161经RPA招募至复制叉
确定ZFP161在RPA下游被招募至复制叉
敲低RPA32后检测ZFP161 foci；用iPOND检测ZFP161在复制叉的富集；体外用纯化RPA和GST-ZFP161进行单链DNA结合实验
分析ZFP161对ATR信号通路的影响
明确ZFP161是否特异性影响ATR激活
在ZFP161缺陷细胞中检测HU、UV、CPT处理后RPA32和Chk1磷酸化，并用DNA-PK、ATM、ATR抑制剂验证；检测IR后ATM通路磷酸化
解析ZFP161与RPA及ATRIP的结构域互作
确定ZFP161作为支架连接RPA和ATRIP的分子基础
用GST pulldown、Co-IP和截短突变体定位ZFP161与RPA32及ATRIP的结合区域，并检测ZFP161缺失对RPA-ATRIP相互作用的影响
检测ZFP161对复制叉稳定性和重启的影响
验证ZFP161及互作区域对停滞复制叉重启的作用
用DNA纤维实验检测复制叉对称性、速度、新起点发放及HU处理后重启，并用野生型或突变体ZFP161回补
检测ZFP161缺失对细胞周期和DNA损伤的影响
评估ZFP161缺失在复制应激下的细胞学后果
用流式细胞术检测细胞周期、γ-H2AX和sub G1群体
体内验证ZFP161对ATR激活和基因组稳定性的作用
确定ZFP161在动物体内维持基因组稳定性
构建ZFP161基因陷阱敲除小鼠，检测UV后皮肤ATR信号、脾细胞γ-H2AX、T细胞中期分裂相和微核
分析ZFP161表达与肿瘤染色体不稳定性的关联
探讨ZFP161表达与肿瘤及染色体不稳定性的关系
分析TCGA结直肠癌数据库中ZFP161表达及染色体不稳定特征
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| McCoy’s 5A培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | VE-822 | Selleckchem | s7102 |
| NU7441 | selleckchem | S2638 | |
| KU55933 | abcam | ab120637 | |
| 质粒构建 | pCMV6-Myc-ZFP161质粒 | ORIGENE | -- |
| pGEX4T-2载体 | Clontech | -- | |
| LentiCRISPR v2载体 | Addgene | -- | |
| Western blot | 抗磷酸化RPA32（S4/8）抗体 | Bethyl Laboratories | A300-245A |
| 抗磷酸化RPA32（T21）抗体 | Abcam | ab109394 | |
| 抗磷酸化RPA32（S33）抗体 | Bethyl Laboratories | A300-246A-M | |
| 抗RPA70抗体 | Bethyl Laboratories | A300-241A | |
| 抗RPA32抗体 | Bethyl Laboratories | A300-244A | |
| 抗RPA32抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56770 | |
| 抗γH2AX抗体 | EMD Millipore Crop | 2884537 | |
| 抗γH2AX抗体 | Bethyl Laboratories | A300-081A | |
| 抗PCNA抗体 | CST | 2586 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| 抗磷酸化Chk1（S345）抗体 | CST | 2348 | |
| 抗Chk1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8408 | |
| 抗磷酸化Chk2（T68）抗体 | CST | 2197S | |
| 抗Chk2抗体 | CST | 6334 | |
| 抗磷酸化ATR（T1989）抗体 | Genetex | GTX128145 | |
| 抗ATR抗体 | CST | 13934 | |
| 抗ATR抗体 | Abcam | ab2905 | |
| 抗ATR抗体 | Novus | nb100-308 | |
| 抗TopBP1抗体 | Bethyl Laboratories | A300-111A | |
| 抗Rad17抗体 | Santa Cruz | sc-17761 | |
| 抗ATRIP抗体 | CST | 2737 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-lg | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma | A2228 | |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz | sc805 | |
| 抗HA抗体 | Sigma | H6908 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F7425 | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz | sc-40 | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz | sc764 | |
| 抗GFP抗体 | Santa Cruz | sc-9996 | |
| 流式分析 | 抗CD71抗体 | eBioscience | 11-0711-82 |
| Western blot | 抗SMC1抗体 | Epitomics | 2437-1 |
| 抗磷酸化SMC1（S957）抗体 | CST | 4805 | |
| 抗磷酸化SMC1（S966）抗体 | Bethyl Laboratories | A300-050A | |
| 抗KAP1抗体 | Bethyl Laboratories | A300-274A | |
| DNA转染 | TransIT-X2转染试剂 | MIRUS Bio | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A珠 | Amersham Biosciences | -- |
| 蛋白纯化 | Affi-Gel Blue基质 | Bio-Rad | -- |
| 羟基磷灰石柱 | Bio-Rad | -- | |
| Mono-Q柱 | Pharmacia | -- | |
| DNA纤维实验 | 抗BrdU抗体 | BD Bioscience | 347580 |
| 抗BrdU抗体 | Abcam | ab6326 | |
| 中期染色体铺片 | 秋水仙胺 | KaryoMAX, GibcoBRL | -- |
| Giemsa染液 | Sigma | -- | |
| 微核实验 | 肝素 | Calbiochem | -- |
| FITC标记CD71抗体 | eBioscience | -- | |
| 流式分析 | PI/RNase溶液 | Thermo Fisher | -- |
| Nxt Attune流式细胞分析仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 激光微辐照 | Micropoint激光照明与消融系统 | ANDOR | -- |
| 免疫荧光 | Nikon eclipse 80i荧光显微镜 | Nikon | -- |
| Western blot | Tanon 5200成像系统 | Tanon | -- |
| Kodak X-OMAT-2000A | Kodak | -- | |
| 小鼠模型构建 | ZFP161缺陷胚胎干细胞（CE0112） | Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) | CE0112 |
| 抗体来源 | 抗磷酸化KAP1（S824）抗体 | Cocalico biologicals | -- |
| 抗磷酸化ATR（T1989）抗体 | GenScript | -- | |
| 抗磷酸化RPA32（S4/8）抗体 | GenScript | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ZFP161敲除细胞构建与验证 | sgRNA序列CACCGGGGAAGACGTTTTCTGATGA和CACCGGGCAGGCAATCTGCTCCCGA；所用细胞系为HCT116和U2OS；敲除克隆#1和#2经测序验证移码 阅读提示：Methods中shRNAs and sgRNAs小节；Supplementary Fig. 1F |
| DNA损伤敏感性克隆形成实验 | 每孔500细胞、三个重复；HU、CPT、UV、5-FU浓度梯度；处理10–14天；结果以接种效率归一化 阅读提示：Methods中Colony formation assay小节；Fig. 1a–d及Supplementary Fig. 1A–E |
| ATR信号激活检测 | 10 mM HU处理2小时；RPA32 S4/8、S33和Chk1 S345磷酸化检测；ATR抑制剂VE-822、DNA-PK抑制剂NU7441、ATM抑制剂KU55933的对照设置 阅读提示：Fig. 3b及Supplementary Fig. 1I；Results中ZFP161 is involved in ATR related DNA damage response小节 |
| iPOND复制叉蛋白分离 | EdU 10 µM标记20分钟；4 mM HU处理2小时；click反应体系含1 mM biotin azide、100 mM CuSO4、20 mg/ml sodium L-ascorbate；链霉亲和素珠富集 阅读提示：Methods中iPOND小节；Fig. 2b、2d、4l |
| ZFP161结构域互作定位 | ZFP161 T2为氨基酸291–316、D3为缺失氨基酸141–210；HEK293T转染48小时；S-tag RPA32和Myc-ATRIP共转染条件 阅读提示：Fig. 4d–k及Supplementary Fig. 2B–G |
| DNA纤维复制叉重启实验 | IdU 25 µM 20分钟、CldU 200 µM 20分钟；4 mM HU处理2小时；纤维长度以Image J测量；WT与ZFP161敲除及D3、T2突变体回补分组 阅读提示：Methods中DNA fiber assay小节；Fig. 5a–f |
| ZFP161敲除小鼠体内验证 | ZFP161 ES细胞CE0112注射C57BL/6NHsd囊胚；小鼠6–12周龄；每基因型3只、每只50个中期分裂相；UV处理后皮肤组织ATR信号检测 阅读提示：Methods中Generation of ZFP161−/− mouse model、Preparation of mouse splenocyte and metaphase spread小节；Fig. 6a–g |
| TCGA染色体不稳定性分析 | 32对结直肠癌患者样本；ZFP161表达以log(FPKM+1)表示；低、中、高染色体不稳定特征按四分位数划分；非配对t检验 阅读提示：Methods中Chromatin instability signature小节；Fig. 6h–l |