BRAF泛素化链型及E3连接酶鉴定
确定BRAF多泛素化的连接类型及催化E3连接酶
在293T细胞中共转染Flag-BRAF与HA-泛素K-only或KR突变体，结合Ni-NTA纯化检测泛素化；筛选NEDD4家族E3；体外重构泛素化反应；鉴定BRAF泛素化赖氨酸位点并构建5KR突变体。
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ITCH介导的BRAF K27连接泛素化衔接细胞因子应答以维持MEK-ERK信号传导
K27-linked ubiquitination of BRAF by ITCH engages cytokine response to maintain MEK-ERK signaling.
实验完整度
高包含体外重构泛素化/激酶/磷酸酶实验、多种黑色素瘤细胞系、MEFs、M2巨噬细胞共培养及裸鼠移植瘤模型，并有功能与机制验证
主要模型
BRAFWT黑色素瘤细胞系（WM1346、WM3918等） BRAFV600E黑色素瘤细胞系（1205Lu、A375） Itch-/-与Jnk1-/-;Jnk2-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） 裸鼠皮下WM1346移植瘤模型
重点核对
TNFα处理浓度50 ng·ml−1及所示时间点 ITCH敲低或敲除（shITCH、Itch-/-）及WT/CS-ITCH回补 BRAF泛素化位点KR突变（5KR：K164R/K473R/K570R/K698R/K700R） 裸鼠皮下接种1×10⁶个WM1346细胞，每组n=6 多西环素诱导shITCH剂量1 μg·ml−1处理48 h或625 mg·kg−1饲料14天
摘要
BRAF在激活MEK/ERK通路以驱动肿瘤发生中发挥不可或缺的作用。受体酪氨酸激酶和RAS介导的BRAF激活已被广泛表征，然而除生长因子外的刺激如何精细调控BRAF功能仍不清楚。在此，我们报道在黑色素瘤细胞中，响应促炎细胞因子时，BRAF被ITCH泛素E3连接酶催化发生赖氨酸27连接的多泛素化。BRAF的赖氨酸27连接泛素化招募PP2A以拮抗S365磷酸化并破坏与14-3-3的抑制性相互作用，导致BRAF持续激活及随后MEK/ERK信号的升高。在生理层面，促炎细胞因子激活ITCH以维持BRAF活性并促进黑色素瘤细胞的增殖和侵袭，而泛素化缺陷的BRAF突变体表现出激酶活性受损和致瘤性降低。总之，我们的研究揭示了ITCH介导的BRAF泛素化在协调黑色素瘤细胞中细胞因子与MAPK通路激活信号之间的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 除生长因子外，促炎细胞因子如何精细调控BRAF活性及MEK/ERK信号传导？
- 核心机制
- 促炎细胞因子通过JNK激活ITCH，ITCH催化BRAF K27连接多泛素化；泛素链招募PP2A去磷酸化p-S365并破坏14-3-3与BRAF的抑制性结合，从而维持BRAF激活和MEK/ERK信号。
- 主要证据
- 体外泛素化与激酶/磷酸酶实验、BRAF泛素化位点KR突变体、ITCH敲低/敲除与回补、黑色素瘤细胞系及MEFs中TNFα/IL-1β处理、M2巨噬细胞共培养及裸鼠移植瘤实验。
- 研究意义
- 揭示ITCH介导的BRAF泛素化在协调细胞因子与MAPK通路激活中的作用，提示ITCH可能作为BRAFWT黑色素瘤的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ITCH与BRAF相互作用结构域定位
确定介导ITCH-BRAF结合的BRAF结构域及ITCH结构域
通过截短体和点突变结合免疫共沉淀及GST pull-down，定位BRAF激酶域内脯氨酸富集基序（S675/P676、P751/P754）与ITCH WW域。
ITCH对MEK/ERK信号及细胞生长的调控
验证ITCH对BRAF下游MEK/ERK活性及黑色素瘤细胞生长的作用
在MEFs和黑色素瘤细胞中敲低/敲除ITCH，检测p-MEK/p-ERK及BRAF泛素化；WT-ITCH或CS-ITCH回补；克隆形成、3D成球及多西环素诱导的移植瘤实验。
细胞因子诱导BRAF泛素化及JNK/ITCH依赖验证
验证促炎细胞因子通过JNK/ITCH促进BRAF泛素化和MEK/ERK激活
TNFα或IL-1β处理黑色素瘤细胞和黑色素细胞，检测BRAF泛素化及p-MEK/p-ERK；利用Itch-/-、Jnk1-/-;Jnk2-/- MEFs和JNK敲低验证依赖性；M2-THP1共培养及TNFα中和抗体实验。
泛素化缺陷BRAF突变体功能验证
验证BRAF泛素化对其激酶活性及细胞功能的必要性
比较WT-BRAF与KR突变体或ITCH结合缺陷突变体激活MEK/ERK的能力；体外激酶动力学；在BRAF敲低黑色素瘤细胞中回补WT或5KR-BRAF，检测增殖、侵袭、软琼脂克隆形成和移植瘤生长。
泛素化调控14-3-3结合及PP2A招募机制
阐明K27泛素链如何破坏14-3-3抑制并招募PP2A去磷酸化S365
体外泛素化后检测BRAF与14-3-3、PP2A亚基结合；PP2A磷酸酶实验及动力学；敲低PPP2CA或PPP2R2A检测p-S365-BRAF和MEK/ERK；S365A回补5KR-BRAF实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达与修饰变化
验证免疫与微环境效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 白细胞介素4 | -- | -- | |
| 白细胞介素13 | -- | -- | |
| EZ-Tet-pLKO-Hygro载体 | Addgene | 85972 | |
| pCINeo-myc-Itch质粒 | Addgene | 11427 | |
| pRK5-HA-泛素-WT质粒 | Addgene | 17608 | |
| pRK5-HA-泛素-K0质粒 | Addgene | 17603 | |
| pRK5-HA-泛素-K27质粒 | Addgene | 22902 | |
| pRK5-HA-泛素-K29质粒 | Addgene | 22903 | |
| pRK5-HA-泛素-K48质粒 | Addgene | 17605 | |
| pRK5-HA-泛素-K63质粒 | Addgene | 17606 | |
| pBABE zeo PPP2CA质粒 | Addgene | 10689 | |
| pMIG-PP2A-Abeta质粒 | Addgene | 15248 | |
| pMIG FLAG B55 alpha质粒 | Addgene | 13804 | |
| pMIG-Aalpha WT质粒 | Addgene | 10884 | |
| V245 pCEP-4HA B56alpha质粒 | Addgene | 14532 | |
| QuikChange XL定点突变试剂盒 | Agilent | -- | |
| 蛋白酶抑制 | 蛋白酶抑制剂 | Thermo Scientific | -- |
| 磷酸酶抑制 | 磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白定量 | Bio-Rad蛋白定量试剂 | Bio-Rad | -- |
| Bio-Rad Model 680酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein G Sepharose磁珠 | GE Healthcare | -- |
| 抗Flag琼脂糖珠 | Sigma | A-2220 | |
| 抗HA琼脂糖珠 | Sigma | A-2095 | |
| 免疫印迹 | 抗BRAF抗体 | Cell Signaling Technology | 9433 |
| 抗CRAF抗体 | Cell Signaling Technology | 9422 | |
| 抗pT202/pY204-ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗pS217/pS221-MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| 抗MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| 抗SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗pT183/pY185-SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| 抗JunB抗体 | Cell Signaling Technology | 3753 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| 抗RAS抗体 | Cell Signaling Technology | 3339 | |
| 抗p-S259-CRAF抗体 | Cell Signaling Technology | 9421 | |
| 抗K48连接泛素抗体 | Cell Signaling Technology | D9D5 | |
| 人TNFα中和单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 7321 | |
| 抗GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2622 | |
| 抗FLIP抗体 | Santa Cruz | H-150 | |
| 抗pS63-c-Jun抗体 | Santa Cruz | KM-1 | |
| 抗p-S621-Raf-1抗体 | Santa Cruz | E-1 | |
| 抗c-Myc抗体 | Santa Cruz | 9E10 | |
| 多克隆抗HA抗体 | Santa Cruz | Y-11 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Bethyl Labs | T-5168 | |
| 抗vinculin抗体 | Bethyl Labs | V-4505 | |
| 多克隆抗Flag抗体 | Sigma | F-2425 | |
| 单克隆抗Flag抗体 | Sigma | F-3165 | |
| 过氧化物酶标记抗小鼠二抗 | Sigma | A-4416 | |
| 过氧化物酶标记抗兔二抗 | Sigma | A-4914 | |
| 抗K27连接泛素抗体 | Abcam | ab181537 | |
| 单克隆抗HA抗体 | Covance | MMS-101P | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽Sepharose 4B | GE Healthcare | -- |
| 体外翻译 | TnT快速偶联转录/翻译系统 | Promega | -- |
| 激酶动力学检测 | ADP-Glo激酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| 磷酸酶活性检测 | 孔雀石绿磷酸检测液 | Promega | -- |
| 体外泛素化 | 泛素或泛素变体 | Boston Biochem | -- |
| 质谱分析 | ZipTip-C18移液枪头柱 | Millipore | -- |
| UHPLC Ultimate 3000液相色谱仪 | Dionex | -- | |
| Q-Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 克隆形成染色 | 结晶紫 | -- | -- |
| 软琼脂克隆染色 | 碘硝基四氮唑氯化物 | -- | -- |
| Matrigel侵袭实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 鬼笔环肽-AF594 | -- | -- | |
| Transwell共培养 | Transwell小室 | BD Biosciences | -- |
| 动物实验 | 含多西环素饲料 | Envigo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞因子处理与BRAF泛素化检测 | TNFα浓度50 ng·ml−1及处理时间；IL-1β浓度文中未明确说明；MG132 10 μM预处理12 h（部分免疫沉淀实验） 阅读提示：Methods中Immunoblots and immunoprecipitation及Fig. 4图注 |
| ITCH敲低/敲除与回补 | shITCH靶序列来自OpenBiosystems RHS4533-EG83737；多西环素1 μg·ml−1处理48 h；WT-ITCH与CS-ITCH回补；Itch-/- MEFs来源 阅读提示：Methods中Plasmids、Cell culture及Fig. 3图注 |
| BRAF泛素化位点突变 | 5KR突变位点K164R/K473R/K570R/K698R/K700R；ITCH结合缺陷突变S675A/P676A和P751A/P754A 阅读提示：Results中BRAF is ubiquitinated by ITCH via the K27-linkage及Fig. 1j、Fig. 2g–j |
| 体外泛素化与激酶/磷酸酶实验 | E1 50 nM、UBCH7 500 nM、泛素1 μg、GST-ITCH 500 ng、30 °C 60 min；激酶实验GST-MEK1 0.2 μg、0.1 mM ATP、30 °C 15 min；磷酸酶实验30 °C 60 min 阅读提示：Methods中In vitro ubiquitination assay、In vitro kinase assays、In vitro phosphatase assays |
| 移植瘤实验 | 6周龄雄性裸鼠NCRNU-M-M（Taconic）；皮下接种1×10⁶ WM1346细胞；每组n=6；多西环素饲料625 mg·kg−1给14天；肿瘤体积公式L×W²×0.5 阅读提示：Methods中Xenograft tumor growth及Fig. 3l–n、Fig. 7m–n图注 |
| M2巨噬细胞共培养 | THP1经TPA 10 ng·mL−1 24 h、IL4 20 ng·mL−1和IL13 20 ng·ml−1 48 h分化；共培养监测5天；TNFα中和抗体使用浓度文中未明确说明 阅读提示：Methods中THP1 differentiation and transwell coculture assay及Fig. 4i–l |