构建Src转化细胞模型
建立可用于表征Src调控激酶组的细胞体系
利用逆转录病毒转导在MCF-10A EcoR细胞中表达Src Y527F，获得MCF-10A_Src稳定细胞池；以pBabe空载体转导的MCF-10A_Ctrl为对照。
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Src调控的激酶组特征鉴定揭示SGK1是Src诱导转化的重要介质
Characterization of the Src-regulated kinome identifies SGK1 as a key mediator of Src-induced transformation.
实验完整度
高包含体外细胞模型、3D培养、siRNA功能筛选、TNBC/NSCLC细胞系验证及小鼠异种移植体内验证，并明确机制验证
主要模型
MCF-10A_Ctrl与MCF-10A_Src乳腺上皮细胞 MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞 A549非小细胞肺癌细胞 BALB/c裸鼠MDA-MB-231原位异种移植瘤模型
重点核对
MCF-10A_Src细胞在−EGF条件下3D Matrigel培养中形成大型异常acini，而MCF-10A_Ctrl不能形成 siRNA SMARTpool筛选：183个靶标，40 nM，反向转染，96 h后检测细胞活力；3D条件下以acinar大小为终点 SGK1敲低或SGK1抑制剂处理增加acini中cleaved Caspase-3阳性率，Ki67不受影响 MDA-MB-231原位移植：2×10^5细胞注射至第四乳腺脂肪垫，多西环素饲料（600 mg/kg）和AZD0530口服灌胃50 mg/kg每日，肿瘤生长20天 Src抑制剂AZD0530（1 μM，16 h）处理MDA-MB-231细胞进行小规模激酶组谱分析
摘要
尽管已取得显著进展，我们对特定癌基因如何转化细胞的理解仍然有限，且很可能低估了下游信号事件的复杂性。为填补这一空白，我们采用基于质谱的化学蛋白质组学来表征癌基因对表达激酶组的整体影响，并对受调控的激酶进行功能注释。作为示例，我们在Src转化的乳腺上皮细胞中鉴定出63种表达和/或磷酸化发生改变的蛋白激酶。整合的siRNA筛选鉴定出包括SGK1在内的九种激酶是Src诱导转化所必需的。相应地，我们发现Src在三阴性乳腺癌细胞中正向调控SGK1表达，这些细胞表现出由Src家族激酶主导的显著信号网络。此外，联合抑制Src和SGK1比任一单独处理更有效地减少集落形成和异种移植瘤生长。因此，该方法不仅提供了对致癌转化的机制性见解，还有助于设计改进的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌基因Src如何整体影响细胞激酶组的表达与磷酸化，其中哪些激酶是Src诱导细胞转化所必需的？
- 核心机制
- Src通过MEK-Erk和YAP信号通路上调SGK1表达，SGK1通过促进mTOR活化（p-S6增加）抑制凋亡，从而介导Src诱导的细胞转化。
- 主要证据
- 在MCF-10A_Src细胞中鉴定出63种表达和/或磷酸化改变的激酶；siRNA筛选鉴定出9种激酶（包括SGK1）为Src诱导转化所必需；SGK1敲低或抑制增加acini凋亡并降低mTOR活性；在TNBC和NSCLC细胞中Src抑制降低SGK1表达；联合靶向Src和SGK1在体外和体内均比单处理更有效抑制集落形成和肿瘤生长。
- 研究意义
- 该整合策略不仅提供对癌基因诱导细胞转化的机制性见解，还可帮助识别预测细胞对癌基因抑制敏感性的生物标志物，并指导设计克服治疗耐药的联合治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于质谱的激酶组谱分析
表征Src转化对表达激酶组整体磷酸化和表达的影响
对差异SILAC标记的MCF-10A_Ctrl和MCF-10A_Src细胞裂解物进行激酶富集，经胶内或溶液内胰酶消化后，用TiO2富集磷酸肽，再进行LC-MS/MS检测和MaxQuant数据分析。
2D细胞活力siRNA筛选
鉴定Src转化细胞和对照细胞在2D生长中对激酶的依赖性差异
用183个靶标的custom siRNA SMARTpool文库对MCF-10A_Ctrl和MCF-10A_Src细胞进行反向转染，在+EGF和−EGF条件下培养，96 h后以Cell Titer-Glo检测细胞活力。
3D acini形成功能筛选
在更接近转化的3D条件下鉴定调控Src诱导转化表型的激酶
MCF-10A_Src细胞反向转染siRNA SMARTpool后，接种于Matrigel进行3D培养，−EGF条件下形成acini，测量acinar大小；对初筛命中靶标进行siRNA去卷积验证。
SGK1功能与机制验证
验证SGK1在Src诱导转化中的作用及其上下游信号机制
通过Western blot确认SGK1表达和NDRG1磷酸化；使用MEK抑制剂trametinib、YAP抑制剂verteporfin或YAP siRNA处理；SGK1敲低、过表达或抑制剂处理acini；免疫荧光检测cleaved Caspase-3和Ki67；Western blot检测mTOR活性（p-S6）。
TNBC和NSCLC细胞中Src-SGK1轴验证
验证SGK1在Src下游发挥作用是否见于人癌细胞
在TNBC细胞系（Hs578T、MDA-MB-231、MDA-MB-468）和A549 NSCLC细胞中，用AZD0530或PP2抑制Src或siRNA敲低Src，检测SGK1表达；建立四环素诱导SGK1 shRNA稳定池，进行集落形成实验，并联合Src抑制剂处理。
体内异种移植瘤验证
验证联合靶向Src和SGK1在体内对肿瘤生长的影响
将表达四环素诱导SGK1 shRNA#2或空载体的MDA-MB-231细胞原位注射至BALB/c裸鼠第四乳腺脂肪垫，给予多西环素饲料和AZD0530口服灌胃，测量肿瘤体积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 激酶组富集 | Purvalanol B | Tocris | -- |
| CTx-0294885 | SYNkinase | -- | |
| SU6668 | Biochempartner Chemical | -- | |
| VI16832 | Evotec | -- | |
| 磷酸肽富集 | 二氧化钛 | GL Sciences | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo Electron | -- |
| Q-Exactive Plus-Orbitrap质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | Millipore | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 马血清 | Invitrogen | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma | -- | |
| 霍乱毒素 | Sigma | -- | |
| 牛胰岛素 | Sigma | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Life Technologies | 11875119 | |
| 胎牛血清 | Fisher Biotec | S-FBS-US-015 | |
| Actrapid笔芯胰岛素 | Clifford Hallam Healthcare | -- | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 细胞活力检测 | Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测 | Promega | -- |
| Synergy H4高通量多模式微孔板检测仪 | BioTek | -- | |
| siRNA转染 | DharmaFECT 3转染试剂 | Dharmacon RNAi Technologies | -- |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠F(ab)’2片段 | Jackson ImmunoResearch | 115-006-006 |
| Fluoromount G封片剂 | Electron Microscopy Services | 1798425 | |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 |
| 泛14-3-3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1657 | |
| MAP4K5（KHS）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6429 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma | T5168 | |
| SGK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3272 | |
| SGK1抗体 | Cell Signaling Technology | 12103 | |
| 磷酸化Erk-T202/Y204抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| Erk抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| 磷酸化JNK-T183/Y185抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 磷酸化p38-T180/Y182抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 磷酸化YAP-S127抗体 | Cell Signaling Technology | 4911 | |
| YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 磷酸化NDRG1-T346抗体 | Cell Signaling Technology | 5482 | |
| NDRG1抗体 | Cell Signaling Technology | 9485 | |
| 磷酸化S6-S235/236抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 磷酸化GSK3α/β-S21/9抗体 | Cell Signaling Technology | 9331 | |
| 磷酸化Src-Y416抗体 | Cell Signaling Technology | 2123 | |
| 免疫荧光 | cleaved Caspase-3（Asp175）抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Ki67抗体 | Thermo Fisher | RM-9106 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor® 488 | Life Technologies | A-21206 | |
| 药物处理 | AZD0530 | Selleck | S1006 |
| SGK1抑制剂 | Reagency | RGNCY-0058 | |
| 雷帕霉素 | Sigma | R0395 | |
| PP2 | Sigma | P0042 | |
| 维替泊芬 | Sigma | SML0534 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma | D9542 |
| 药物处理 | 曲美替尼 | MedChem Express | HY-10999 |
| RNA提取与逆转录 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen GmbH | -- |
| 逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| qPCR | FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
| C1000 Touch™热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| 3D细胞成像 | Leica AF6000LX活细胞成像工作站 | Leica | -- |
| 免疫荧光成像 | Leica SP8倒置共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Src转化细胞模型构建 | 细胞系来源（MCF-10A EcoR）、逆转录病毒转导方法、嘌呤霉素筛选浓度2 μg/mL、对照载体（pBabe空载体） 阅读提示：Methods中Generation of stable cell lines小节 |
| 基于质谱的激酶组谱分析 | SILAC标记氨基酸浓度（Arg 18.43 mg/L，Lys 91.25 mg/L）、kinobead cocktail组成及用量（2 ml）、蛋白量（100 mg）、质谱仪器型号、MaxQuant参数、fold change阈值1.5及重复数（三次独立实验含标签互换，共六个生物学重复） 阅读提示：Methods中MS-based kinomic profiling小节 |
| 2D细胞活力siRNA筛选 | siRNA文库靶标数（183）、转染浓度40 nM、转染试剂DharmaFECT 3、细胞接种密度（+EGF 4×10^3/孔，−EGF 6.5×10^3/孔）、检测时间（96 h）、活力检测方法（Cell Titer-Glo） 阅读提示：Methods中High-throughput screen for monolayer (2D) proliferation小节及Fig. 3c图注 |
| 3D acini形成功能筛选 | Matrigel包被体积（40 μl/孔）、细胞接种密度（约800细胞/孔）、培养基成分（2% Matrigel、2%马血清、无EGF）、培养时间（至11天）、换液频率（每3-4天）、acinar大小测量方法（ImageJ） 阅读提示：Methods中Three-dimensional (3D) cultures of MCF-10As和Functional screen for 3D proliferation小节及Fig. 4图注 |
| SGK1功能与机制验证 | SGK1 siRNA浓度40 nM、SGK1抑制剂浓度10 μM、trametinib处理时间24 h、verteporfin浓度0.5和2 μM及处理时间16 h、YAP siRNA浓度25 nM、免疫荧光分析acini数量（至少50个/重复） 阅读提示：Methods中相关处理小节及Fig. 5、Fig. 6图注 |
| TNBC和NSCLC细胞中Src-SGK1轴验证 | AZD0530或PP2处理浓度（文中未明确说明，仅说明过夜处理）、Src siRNA浓度20 nM及72 h、四环素浓度1 μg/ml及48 h、集落形成实验接种细胞数（100细胞/孔） 阅读提示：Methods中Colony formation assay、Transfections小节及Fig. 7、Fig. 8图注；AZD0530和PP2浓度需回看Fig. 7b、c和Fig. 8a图注确认 |
| 体内异种移植瘤验证 | 细胞接种数量（2×10^5）、小鼠品系和周龄（6-8周龄雌性BALB/c无胸腺小鼠）、注射部位（第四乳腺脂肪垫）、多西环素饲料浓度（600 mg/kg）、AZD0530剂量（50 mg/kg每日口服灌胃）、肿瘤生长时间（20天）、每组小鼠数（对照7只，其他三组8只） 阅读提示：Methods中Xenografts小节及Fig. 9图注 |