AAA中netrin-1表达验证
验证netrin-1在人类和小鼠AAA病变主动脉中的表达水平及细胞定位。
对Ang II诱导的ApoE−/−小鼠AAA主动脉及人动脉瘤组织进行RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色，检测netrin-1表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
巨噬细胞来源的netrin-1通过激活血管平滑肌细胞中的MMP3促进腹主动脉瘤形成
Macrophage-derived netrin-1 promotes abdominal aortic aneurysm formation by activating MMP3 in vascular smooth muscle cells.
实验完整度
高包含单细胞RNA测序、多种基因敲除小鼠模型、骨髓嵌合体、体外细胞实验及机制验证（钙流、NFATc3、受体阻断）
主要模型
ApoE−/−小鼠Ang II诱导的腹主动脉瘤模型 Ntn1fl/fl/LysM-Cre小鼠（巨噬细胞特异性Ntn1敲除） 骨髓嵌合体小鼠 小鼠原代血管平滑肌细胞（VSMCs）
重点核对
Ang II输注剂量1 μg/kg/min，持续28天 巨噬细胞特异性Ntn1敲除（LysM-Cre） 重组netrin-1刺激VSMCs的浓度（0.625、1.25、2.5 μg/ml）和时间（6 h或30 min） MMP3活性检测（荧光法） BAPTA（10 μM）和VIVIT（1 μM）预处理
摘要
腹主动脉瘤（AAA）的特征是广泛的细胞外基质（ECM）碎裂和炎症。然而，这些事件如何耦合并导致局灶性血管损伤的机制尚不清楚。在这里，我们通过对病变主动脉的单细胞RNA测序报告，神经元导向线索netrin-1可以在巨噬细胞驱动的损伤和ECM降解的界面发挥作用。Netrin-1表达在人类和小鼠动脉瘤巨噬细胞中达到峰值。巨噬细胞中netrin-1的靶向缺失可保护小鼠免于发生AAA。通过其受体neogenin-1，netrin-1诱导强烈的细胞内钙流，这是血管平滑肌细胞转录调节和持续性催化激活基质金属蛋白酶-3（MMP3）所必需的。MMP3的缺乏减少了ECM损伤和小鼠发生AAA的易感性。在这里，我们确立netrin-1是介导AAA中炎症与ECM慢性侵蚀之间动态串扰的主要信号。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 巨噬细胞来源的netrin-1是否以及如何耦联炎症与细胞外基质降解，从而促进腹主动脉瘤的形成。
- 核心机制
- 巨噬细胞分泌的netrin-1通过结合VSMCs上的neogenin-1受体，诱导细胞内钙流和NFATc3核转位，进而转录调控并持续激活MMP3，导致ECM降解和AAA形成。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序显示Netrin-1在动脉瘤巨噬细胞中高表达；巨噬细胞特异性Ntn1敲除或造血系统Ntn1缺失保护小鼠免于AAA；体外实验证明netrin-1通过neogenin-1诱导VSMCs中MMP3活性，且依赖钙离子和NFATc3；MMP3全敲或基质细胞MMP3缺失减轻AAA。
- 研究意义
- 确立了netrin-1作为介导炎症与ECM慢性侵蚀之间动态串扰的主要信号，提示干预该串扰可能成为未来AAA药物开发的治疗策略基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
造血系统Ntn1缺失对AAA的影响
探究造血系统来源netrin-1在AAA发展中的作用。
通过胎儿肝细胞移植构建Ntn1−/−→ApoE−/−和WT→ApoE−/−嵌合体小鼠，Ang II输注后评估AAA发生率、严重程度、主动脉直径、巨噬细胞浸润和弹性蛋白降解。
单细胞RNA测序鉴定netrin-1来源细胞
确定AAA主动脉中表达netrin-1的免疫细胞亚群。
对病变主动脉进行单细胞RNA测序，分析Ntn1在各免疫细胞簇中的表达比例。
巨噬细胞特异性Ntn1敲除对AAA的影响
直接验证巨噬细胞来源netrin-1在AAA中的作用。
构建Ntn1fl/fl/LysM-Cre+/−小鼠，注射PCSK9 AAV联合Ang II诱导AAA，评估发生率、主动脉直径、弹性蛋白完整性和巨噬细胞浸润。
RNA-seq筛选下游效应分子
寻找netrin-1调控的下游靶基因。
对WT→ApoE−/−和Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠主动脉进行RNA-seq，结合RT-PCR和免疫荧光验证Mmp3表达。
MMP3在AAA中的作用验证
验证MMP3对AAA发展的直接影响。
对Mmp3−/−小鼠进行Ang II输注联合PCSK9 AAV注射，评估AAA发生率和弹性蛋白降解。
巨噬细胞来源MMP3的作用
明确巨噬细胞来源MMP3是否足以驱动AAA。
构建WT→WT和Mmp3−/−→WT骨髓嵌合体，PCSK9 AAV联合Ang II处理后评估AAA指标。
VSMC来源MMP3的作用
验证非造血来源（包括VSMCs）MMP3对AAA的贡献。
构建WT→Mmp3−/−和WT→WT骨髓嵌合体，PCSK9 AAV联合Ang II处理后评估AAA发生率和弹性蛋白降解。
netrin-1通过neogenin-1调控VSMCs中MMP3的机制
解析netrin-1诱导VSMCs中MMP3活性的信号通路。
用重组netrin-1刺激VSMCs，检测钙流（Fura-2）、NFATc3核转位（免疫荧光）、MMP3活性（荧光法），并使用BAPTA、VIVIT、neogenin-1中和抗体或siRNA干预。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| AAA诱导 | Alzet渗透泵（型号2004） | Durect Corporation | 0000298 |
| 血管紧张素II | Bachem | H-1705 | |
| 细胞培养 | II型胶原酶 | Sigma Aldrich | C6885 |
| 弹性蛋白酶 | Worthington Biochemistry | LS002292 | |
| DMEM培养基 | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10082147 | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 70微米细胞筛网 | BD Biosciences | 340607 | |
| Alexa Fluor 405抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab210128 | |
| 人原代血管平滑肌细胞 | ATCC | CRL-1999TM | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | ATCC | CRL-2991TM | |
| 支原体污染检测试剂盒 | Invitrogen | M7006 | |
| 药物处理 | VIVIT肽 | Tocris Biosciences | 3905 |
| BAPTA钙螯合剂 | Invitrogen | B1205 | |
| 抗体阻断 | 山羊抗neogenin-1抗体 | R&D Systems | AF1079-SP |
| 山羊抗Unc5b抗体 | R&D Systems | AF1006-SP | |
| 山羊IgG对照 | R&D Systems | AB-108-C | |
| 共培养 | Corning Transwell多孔板（聚碳酸酯膜插入物） | ThermoFisher | 07-200-147 |
| siRNA转染 | Neo1 siRNA | Sigma Aldrich | SASI_Mm02_00291095 |
| Unc5b siRNA | Dharmacon | E-050737-00-0005 | |
| siRNA转染试剂系统 | Santacruz Biotechnology | sc-45064 | |
| 非靶向siRNA对照序列 | Santacruz Biotechnology | SC-37007 | |
| MMP3活性检测 | MMP3活性荧光检测试剂盒 | Biovision | K783–100 |
| 流式细胞术 | VioGreen抗CD45抗体 | Miltenyi biotechnology | 130-102-412 |
| PE-Vio770抗F4/80抗体 | Miltenyi biotechnology | 130-102-193 | |
| APC抗CD11b抗体 | Miltenyi biotechnology | 130-091-241 | |
| 免疫荧光 | 鸡抗小鼠/人netrin-1抗体 | Abcam | ab39370 |
| 大鼠抗小鼠CD68抗体 | Bio-Rad | MCA1957 | |
| 小鼠抗人CD68抗体 | Bio-Rad | MCA5709 | |
| 兔抗小鼠/人MMP3抗体 | Abcam | ab53015 | |
| 山羊抗小鼠neogenin-1抗体 | R&D Systems | AF1079 | |
| 抗小鼠α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab7817 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗小鼠 | Invitrogen | A11004 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔 | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗兔 | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗大鼠 | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa Fluor 568驴抗山羊 | Invitrogen | A-11057 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗鸡 | Invitrogen | A11039 | |
| Lab-Tek腔室载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 细胞刺激 | 重组小鼠netrin-1 | R&D Systems | 1109-N1 |
| 免疫荧光 | 小鼠抗NFATc3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8405 |
| DAPI染料 | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 568鬼笔环肽 | Invitrogen | A12380 | |
| 组织包埋 | 最佳切割温度包埋剂（OCT） | Fisher Scientific | 4585 |
| 组织染色 | Verhoeff Van Gieson弹性蛋白染色试剂盒 | Astral Diagnostics | 25089-1 |
| 伊红515 LT | Leica Biosystems | 3801619 | |
| Western blot | RIPA缓冲液 | Cell Signaling Technologies | 98065 |
| Mini-PROTEAN TGX凝胶 | Bio-Rad | 456-8034 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | BR20160719 | |
| 抗netrin-1抗体 | Abcam | ab126729 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 山羊抗兔生物素化抗体 | Sigma Aldrich | A0545 | |
| 山羊抗小鼠生物素化抗体 | Sigma Aldrich | A9917 | |
| Clarity Western ECL发光液 | Bio-Rad | 170-5060 | |
| 钙成像 | 钙离子荧光探针Fura-2 | Thermo Fisher Scientific | F1221 |
| 96孔透明底黑色聚苯乙烯微孔板 | Corning | 3603 | |
| 无钙DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21068028 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion, Life Technologies | 15596026 |
| Direct-zol RNA小量制备试剂盒 | Zymo Research | R2052 | |
| 逆转录 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 |
| RT-qPCR | KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒 | KAPA Biosystems | KK4602 |
| RNA-seq | RNEasy纤维组织RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74704 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AAA诱导模型 | Ang II输注剂量1 μg/kg/min，持续28天；ApoE−/−小鼠背景；PCSK9 AAV剂量1011基因组拷贝；Western diet成分（21%脂肪，0.3%胆固醇） 阅读提示：Methods中AAA induction in mice小节及图注 |
| 巨噬细胞特异性Ntn1敲除 | LysMcre+/−与Ntn1flox/flox杂交策略；敲除效率验证（Supplementary Figure 1b） 阅读提示：Methods中Mice小节及Results对应段落 |
| 骨髓嵌合体构建 | 致死辐照剂量（两次600 cGy）；骨髓细胞移植数量；恢复时间6周 阅读提示：Methods中Mice小节 |
| VSMCs中netrin-1信号通路验证 | 重组netrin-1浓度（2.5 μg/ml）；BAPTA浓度10 μM；VIVIT浓度1 μM；抗neogenin-1抗体浓度10 μg/ml；siRNA序列和转染试剂 阅读提示：Methods中Cell culture小节及图6图注 |
| MMP3活性检测 | 荧光检测试剂盒（K783–100）；VSMCs裂解液蛋白量；检测时间点 阅读提示：Methods中MMP3 activity assay小节 |