单细胞RNA-seq分析hiPSC-CMs异质性
识别hiPSC-CMs分化过程中的细胞亚群及其标志基因。
对两个hiPSC系在分化第0、5、14、45天进行10X Chromium单细胞RNA-seq，对第30天细胞进行Fluidigm C1单细胞RNA-seq，使用ICGS等算法进行聚类和标记基因识别。
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利用整合的单细胞异质性分析定义人类心脏转录因子层级
Defining human cardiac transcription factor hierarchies using integrated single-cell heterogeneity analysis.
实验完整度
高包含体外细胞模型、成体心脏组织、单细胞和bulk转录组、CRISPR基因编辑、ChIP-seq、膜片钳、钙成像和CyTOF等多层级功能与机制验证。
主要模型
hiPSC-CMs（CVI0076和CVI0059细胞系） hESC-CMs（HES3细胞系） 成体心脏心房和心室组织
重点核对
hiPSC-CMs分化时间点（第0、5、14、30、45、90天） 基因编辑细胞系（NR2F2GE、TBX5GE、HEY2GE）及其对照 ChIP-seq所用抗体（anti-NR2F2、anti-HEY2、anti-TBX5） 钙成像使用Fura-2 AM（10 µM）和膜片钳记录条件 CyTOF使用37种元素同位素偶联抗体 panel
摘要
人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为人类疾病建模和治疗测试的有力工具。然而，它们的使用仍受限于其不成熟性和异质性。为了表征这种异质性的来源，我们在hiPSC心脏分化过程中以及成体心脏中，随时间应用了互补的单细胞RNA-seq和bulk RNA-seq技术。利用整合的转录组和剪接分析，观察到了超过六个不同的单细胞群体，其中几个在分化第30天的单一时间点同时出现。为了剖析与每个细胞群体相关的不同心脏转录调控因子的作用，我们利用CRISPR基因组编辑和ChIP-seq，结合膜片钳、钙成像和CyTOF分析，系统地测试了三个转录因子（NR2F2、TBX5和HEY2）获得或缺失功能的影响。这些靶点、数据和整合基因组学分析方法为理解体外细胞异质性提供了一个强大的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hiPSC-CMs的异质性来源是什么，以及特定心脏转录因子如何调控不同心肌细胞亚群的功能和成熟状态？
- 核心机制
- NR2F2、TBX5和HEY2通过协同或拮抗调控心脏基因表达，NR2F2促进心房样基因表达，而HEY2促进心室样基因表达和电生理特性。
- 主要证据
- 单细胞RNA-seq识别出多个心肌细胞亚群；CRISPR基因编辑和ChIP-seq揭示转录因子靶基因；钙成像和膜片钳显示HEY2GE和TBX5GE细胞钙处理不成熟，HEY2GE细胞动作电位呈心房样；CyTOF验证MLC2V蛋白表达随时间增加。
- 研究意义
- 这些靶点、数据和整合基因组学分析方法为理解体外细胞异质性提供了强大平台，有助于改进hiPSC-CMs在疾病建模和药物测试中的应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
bulk RNA-seq时间进程分析
验证单细胞亚群与分化时间的关联，并定义分化阶段基因表达特征。
对hiPSC分化第0至90天共13个时间点进行bulk RNA-seq，使用MarkerFinder等算法分析基因表达动态。
ChIP-seq分析转录因子结合位点
鉴定NR2F2、TBX5和HEY2在全基因组范围内的靶基因和调控通路。
对分化第20天的心肌细胞进行NR2F2、TBX5和HEY2的ChIP-seq，使用抗体和蛋白G磁珠进行免疫沉淀，测序并分析峰。
CRISPR/Cas9和TALEN基因编辑构建转录因子敲除细胞系
研究NR2F2、TBX5和HEY2功能缺失对心肌细胞转录组和功能的影响。
使用CRISPR/Cas9或TALEN技术靶向NR2F2、TBX5和HEY2外显子，产生缺失突变，并分化这些细胞系进行RNA-seq和功能分析。
转录因子过表达和RNA-seq
研究NR2F2、TBX5和HEY2过表达对心肌细胞转录组的影响。
使用慢病毒在分化第30天hiPSC-CMs中过表达NR2F2、TBX5或HEY2，并进行RNA-seq。
钙成像和膜片钳电生理分析
评估基因编辑和过表达对心肌细胞钙处理和动作电位的影响。
使用Fura-2 AM进行钙瞬变成像，使用全细胞膜片钳记录动作电位，分析钙瞬变参数和动作电位参数。
CyTOF分析hESC-CMs蛋白表达
在蛋白水平验证MLC2V和MLC2A的表达动态。
对hESC-CMs（HES3）在分化第8、18、30天进行CyTOF分析，使用37种金属偶联抗体 panel。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | BD Bioscience | -- |
| 心肌分化 | CHIR-99021 | Selleckchem | CT99021 |
| IWR-1 | Sigma | I0161 | |
| 不含胰岛素的B27 | Life Technologies | A1895601 | |
| 含胰岛素的B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| 单细胞RNA-seq | 10X Genomics单细胞RNA测序试剂盒v1/v2 | 10X Genomics | -- |
| C1单细胞自动制备IFC用于mRNA测序 | Fluidigm | 5760 | |
| SMARTer超低RNA试剂盒 | Clontech | -- | |
| Nextera XT DNA样本制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1096 | |
| RNA-seq | miRNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| Ovation RNA-Seq系统V2试剂盒 | NuGEN | -- | |
| NEBNext DNA文库制备预混液套装（用于Illumina） | NEB | E6040L | |
| ChIP-seq | 抗NR2F2抗体 | Active Motif | 61213 |
| 抗HEY2抗体 | Proteintech | 10597-1-AP | |
| 抗TBX5抗体 | Sigma | SAB1411311 | |
| 蛋白G Dynabeads | Invitrogen | 10003D | |
| ChIP DNA纯化和浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| 基因编辑 | pSpCas9(BB)-2A-GFP载体 | Addgene | 48138 |
| Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- | |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- | |
| PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 | Clontech | -- | |
| StrataClone平末端PCR克隆试剂盒 | Agilent | -- | |
| QIAprep离心柱小量制备试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 过表达 | mGFP标记的NR2F2慢病毒颗粒 | Origene | RC206753L2V |
| mGFP标记的TBX5慢病毒颗粒 | Origene | RC216520L2V | |
| mGFP标记的HEY2慢病毒颗粒 | Origene | RC202544L2V | |
| 对照GFP Lent-ORF颗粒 | Origene | PS100071V5 | |
| 钙成像 | Fura-2 AM | Invitrogen | -- |
| 免疫细胞化学 | ATTO 550偶联的抗MLC2V抗体 | Synaptic Systems | 310-111AT2 |
| ATTO 647 N偶联的抗MLC2A抗体 | Synaptic Systems | 310-011AT1 | |
| DAPI | -- | -- | |
| CyTOF | 金属偶联抗体 | -- | -- |
| 含铱DNA嵌入剂 | Fluidigm | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPSC-CMs分化 | 分化方案：使用CHIR-99021（6 µM，2天）和IWR-1（5 µM，2天）的小分子Wnt调控 monolayer 分化；细胞系CVI0076和CVI0059；分化时间点0-90天 阅读提示：Materials and Methods: Cardiomyocyte differentiation |
| 单细胞RNA-seq | 10X Chromium平台：细胞数10,376，时间点0、5、14、45天；Fluidigm C1平台：43个细胞，第30天；测序深度和过滤标准 阅读提示：Methods: RNA-sequencing及Supplementary Fig. 1 |
| CRISPR基因编辑 | NR2F2GE1（89 bp缺失）、HEY2GE1（15 bp缺失）、TBX5GE1（29 bp缺失）的靶点序列和验证方法；GE2大片段缺失的guide RNAs 阅读提示：Methods: Gene editing cardiac transcription factors及Supplementary Fig. 4 |
| ChIP-seq | 抗体用量（5 µg），细胞数（分化第20天，N=1），交联和超声条件 阅读提示：Methods: ChIP-sequencing |
| 钙成像 | Fura-2 AM浓度10 µM，负载时间30分钟，Tyrode's溶液配方，刺激频率和记录参数 阅读提示：Methods: Ratiometric Ca2+ transient imaging |
| 膜片钳 | 记录温度36–37°C，pacing 1 Hz，电极电阻2-4 MΩ，动作电位分类标准（APD90/APD50比值） 阅读提示：Methods: Electrophysiological recordings |