条件性PID转基因小鼠的构建与验证
建立可条件性表达Group I Paks肽抑制剂的转基因小鼠并验证其抑制内源性Pak活性的能力。
将GST-PID*片段靶向插入Rosa26位点，构建LSL-PID转基因小鼠；与CDX2P-NLS-Cre小鼠杂交后在肠道表达PID；通过PCR基因分型、Adeno-Cre感染MEF细胞后Western blot检测GST-PID表达及磷酸化Pak水平。
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Group I Paks在Apc驱动的结直肠癌模型中对上皮-间质转化至关重要
Group I Paks are essential for epithelial- mesenchymal transition in an Apc-driven model of colorectal cancer.
实验完整度
高含条件性转基因小鼠模型、原代细胞体外功能验证、RNA-seq及分子机制验证，多层级证据且含功能与机制验证
主要模型
CDX2;APC;PID条件性转基因小鼠（Apc驱动结直肠癌模型） 小鼠原代结肠腺瘤上皮细胞系（PID+与PID-） SW48人结肠癌细胞系异种移植瘤模型 BALB/c nu/nu裸鼠
重点核对
CDX2;APC;PID小鼠（n=15）与CDX2;APC对照（n=21）观察8个月，每两周称重，处死后计数肿瘤数目、腺瘤与腺癌数量及肿瘤面积 原代细胞PID+（#4、7、26）与PID-（#35、48、56）的MTT增殖、Matrigel侵袭（19 h）和迁移实验 RNA-seq及qRT-PCR检测EMT基因、Wnt通路基因和miR-200家族表达，Western blot验证EMT蛋白标志物 LNA-miR-200抑制剂（50 nM，每3天重复转染，最长22天）转染PID+细胞及miR-200簇慢病毒转导PID-细胞进行功能挽救 SW48异种移植瘤（2×10^6细胞皮下接种）给予Frax-1036（30 mg/kg/day）或G-5555（25 mg/kg/day，每日两次）口服灌胃2周
摘要
p21激活激酶（Paks）在致癌信号通路中发挥重要作用，并被认为是多种癌症的潜在治疗靶点。大多数关于Pak功能的研究采用基因敲除或敲低方法，但这些方法会导致这些蛋白的酶活性和支架特性同时丧失，因此可能无法反映小分子抑制剂的效果。在本研究中，我们使用了一种转基因小鼠模型，其中Group I Paks的特异性肽抑制剂在Cre重组酶的作用下条件性表达。利用该模型，我们证明抑制内源性Paks可阻碍Apc驱动的结直肠癌小鼠模型中腺瘤向癌的转变。这些效应通过降低β-catenin活性从而抑制Wnt信号通路，以及抑制由miR-200和Snai1介导的上皮-间质转化程序来介导。这些结果突出了Pak1抑制剂在结直肠癌中的潜在治疗作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Group I Paks的激酶活性是否在Apc驱动的结直肠癌进展中发挥关键作用，以及其通过何种分子机制调控腺瘤向癌的转变。
- 核心机制
- Group I Paks通过磷酸化β-catenin增强Wnt/β-catenin信号，并通过miR-200–ESRP1–CD44可变剪接轴及Snai1磷酸化促进上皮-间质转化程序；抑制Paks可同时削弱Wnt信号和EMT。
- 主要证据
- 在CDX2;APC;PID小鼠中抑制Paks减少肿瘤数目和腺瘤向腺癌进展；PID+原代细胞增殖、侵袭和迁移能力降低，上皮标志物升高、间质标志物降低；miR-200升高、ESRP1表达恢复、CD44v4-10升高而CD44s降低、Snai1磷酸化减少；Snai1 S246A突变体抑制N-Cadherin和Zeb1表达。
- 研究意义
- 结果提示Group I Pak激酶活性是结直肠癌变过程中上皮信号程序的关键调控因子，并支持Group I Paks小分子抑制剂可能用于结直肠癌治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PID表达对肠道发育的基础影响评估
确认PID表达本身不显著改变小鼠肠道结构和基础信号。
将PID小鼠与CDX2P-NLS-Cre小鼠杂交，检查双转基因CDX2;PID小鼠肠道及其他内脏器官组织学，免疫组化检测BrdU和cleaved caspase 3。
PID在Apc驱动结直肠癌模型中的体内抗肿瘤效果评估
验证抑制Group I Paks是否阻碍Apc缺失驱动的腺瘤形成和向腺癌进展。
构建CDX2;APC;PID实验组和CDX2;APC对照组小鼠，观察8个月，每两周称重，处死后计数肠道肿瘤数目、腺瘤和腺癌数量，测量肿瘤面积，H&E染色及免疫组化检测Histone H3、磷酸化Pak和磷酸化Akt。
原代结肠腺瘤上皮细胞的建立及增殖、侵袭和迁移功能验证
在体外验证PID表达对Apc突变结肠上皮细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。
从两组小鼠腺瘤中建立各3株原代结肠细胞系，通过MTT法检测增殖，Matrigel侵袭实验和BioCoat对照 chamber迁移实验检测侵袭和迁移能力，并检测凋亡。
PID表达对Wnt、MAPK、Akt信号及EMT基因表达的影响
解析PID抑制Paks后对致癌信号通路和EMT相关基因表达的影响。
对PID+和PID-原代细胞进行RNA-seq和qRT-PCR检测EMT基因、Wnt通路基因及干细胞相关基因表达，Western blot检测EMT蛋白标志物及MAPK/Akt/β-catenin磷酸化水平；并用Frax-1036处理PID-细胞验证小分子抑制剂效果。
miR-200家族在Pak调控EMT中的功能验证
验证miR-200家族是否介导PID抑制Paks后的上皮样表型和EMT抑制。
检测PID+和PID-细胞中miR-200家族前体表达；用LNA-miR-200抑制剂转染PID+细胞进行侵袭和迁移实验及上皮标志物检测；用慢病毒在PID-细胞中过表达miR-200b-200a-429或miR-200c-141簇，检测上皮和间质标志物。
Group I Paks调控CD44可变剪接及ESRP1的机制验证
探究Pak活性是否通过剪接因子ESRP1调控CD44异构体转换从而影响EMT。
qPCR和Western blot检测PID+与PID-细胞中CD44标准型和变异型表达；亚细胞分级后检测hnRNPM、PCBP1、ESRP1、Snai1及磷酸化Snai1的定位和表达；在PID+细胞中用shRNA敲低ESRP1后检测CD44s和E-Cadherin。
Snai1磷酸化在Pak介导EMT中的作用验证
验证Pak1对Snai1 S246位点磷酸化是否介导EMT表型。
在PID-细胞中表达野生型Snai1或不可磷酸化的Snai1 S246A突变体，检测N-Cadherin、Zeb1、E-Cadherin、ESRP1表达及Snai1核定位；用MG132处理检测Snai1是否经蛋白酶体降解。
小分子Pak抑制剂在结直肠癌异种移植瘤模型中的效果评估
验证小分子Group I Pak抑制剂是否模拟PID的抗肿瘤效果。
用Wnt通路突变SW48细胞皮下接种裸鼠，待肿瘤达40 mm3后随机分组，每日口服Frax-1036、G-5555或溶剂对照，每两天测量体重和肿瘤体积，持续2周。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | Clonase酶混合物 | Life Technology | -- |
| ES细胞培养 | 高糖DMEM | -- | -- |
| ES级胎牛血清 | -- | -- | |
| 重组白血病抑制因子 | -- | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| Lipofectamine 2000 | Life Technology | -- | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| miRCURY抑制剂对照LNA | Exiqon | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 凋亡检测 | HistoGel | Thermo Scientific | -- |
| 细胞增殖检测 | 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT） | -- | -- |
| Perkin Elmer Envision酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 侵袭和迁移实验 | Matrigel侵袭小室和BioCoat对照小室 | BD Biosciences | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| RNA提取与qRT-PCR | Tri试剂 | Sigma | -- |
| DNase I | Life Technology | -- | |
| SuperScript III逆转录酶 | Life Technology | -- | |
| Fast SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| 7500实时定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | Snai1抗体 | abcam | 180714 |
| 山羊抗兔IgG-Alexa-Green 488二抗 | Molecular Probe | A11008 | |
| DAPI | Molecular Probe | -- | |
| 免疫组织化学 | 磷酸化Pak兔多克隆抗体 | Life Technology | 44940 G |
| 磷酸化Mek兔多克隆抗体 | Life Technology | 44460 G | |
| 磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 磷酸化Histone H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9701 | |
| cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Msi1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-135721 | |
| Bmi1抗体 | abcam | ab14389 | |
| ESRP1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-82201 | |
| E-Cadherin抗体 | BD Transduction Laboratories | 610182 | |
| BrdU抗体 | BD Transduction Laboratories | 347580 | |
| Western blot | 抗Zeb1抗体 | Cell Signaling Technology | 3396 |
| 抗Slug抗体 | Cell Signaling Technology | 9585 | |
| 抗Twist抗体 | Cell Signaling Technology | 46702 | |
| 抗Fibronectin抗体 | Cell Signaling Technology | 6238 | |
| 抗Pak1抗体 | Cell Signaling Technology | 2602 | |
| 抗Pak2抗体 | Cell Signaling Technology | 2608 | |
| 抗Pak3抗体 | Cell Signaling Technology | 2609 | |
| 抗Mek抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| 抗Erk抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗磷酸化Erk1/2 (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| 抗磷酸化mTOR (Ser2448)抗体 | Cell Signaling Technology | 2971 | |
| 抗磷酸化β-Catenin (Ser675)抗体 | Cell Signaling Technology | 4176 | |
| 抗GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2622 | |
| 抗cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| 抗磷酸化Pak (Ser141)抗体 | Life Technology | 44940G | |
| 抗磷酸化Mek (Ser298)抗体 | Life Technology | 44460G | |
| 抗Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| 抗β-Catenin抗体 | BD Transduction Laboratories | 610154 | |
| 抗E-Cadherin抗体 | BD Transduction Laboratories | 610182 | |
| 抗N-Cadherin抗体 | BD Transduction Laboratories | 610920 | |
| 抗Occludin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5562 | |
| 抗PCBP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393076 | |
| 抗CD44抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-18849 | |
| 抗Lamin A/C抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7292 | |
| 抗hnRNPM抗体 | Novus Biologicals | TA301557 | |
| 抗ESRP1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-82201 | |
| 抗Snai1抗体 | Abcam | ab180714 | |
| 抗磷酸化Snai1抗体 | Abcam | ab63568 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 药物处理 | Frax1036 | -- | C28H32ClN7O |
| G-5555 | -- | C25H25CIN6O3 | |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | -- | -- | |
| 数据分析 | Image J v1.5 | NIH | -- |
| GraphPrism | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Apc驱动结直肠癌小鼠模型 | 小鼠基因型（CDX2P-NLS-Cre;APCΔ/+;ROSA26-PID与CDX2P-NLS-Cre;APCΔ/+）、Apc loxP等位基因靶向exon 14导致codon 580移码、实验组n=15与对照组n=21、观察8个月、每两周称重、处死标准 阅读提示：Methods中Generation of transgenic mice小节及Fig. 2 legend |
| 原代结肠腺瘤上皮细胞系建立 | 细胞系来源（PID+ #4、7、26；PID- #35、48、56）、培养基（RPMI-1640+10% FBS+2 mM L-glutamine+100 U/ml青霉素/链霉素）、培养条件（37 °C、5% CO2） 阅读提示：Methods中Cell culture, transfections, and transductions小节 |
| 细胞增殖、侵袭和迁移实验 | MTT每孔2×10^3细胞、MTT终浓度0.5 mg/ml、反应4 h、595 nm检测、每组三复孔且实验重复三次；侵袭实验每室2×10^4细胞、迁移19 h、8 μm孔径、计数每室5个随机视野 阅读提示：Methods中Cell proliferation assay和Cell motility and invasion assays小节及Fig. 3 legend |
| miR-200功能干预 | LNA-miR-200浓度50 nM、每3天重复转染、最长22天、对照为miRCURY inhibitor control LNA；慢病毒过表达miR-200b-200a-429或miR-200c-141簇 阅读提示：Methods中Cell culture, transfections, and transductions小节及Fig. 4 legend |
| 小分子Pak抑制剂异种移植瘤实验 | SW48细胞2×10^6皮下接种6周龄BALB/c nu/nu裸鼠、肿瘤达40 mm3后分组、Frax-1036剂量30 mg/kg/day每日一次口服灌胃、G-5555剂量25 mg/kg/day每日两次（间隔6 h）口服灌胃、溶剂组成、每两天测肿瘤体积持续2周 阅读提示：Methods中Tumorigenicity assays和Treatment with Pak inhibitors小节及Supplementary Fig. 4E、4F |
| Western blot与免疫组化抗体条件 | 各抗体货号、稀释比例及来源、亚细胞分级内参（Lamin A/C为核内参、Vinculin为胞质内参）、免疫组化评分标准（0至3+） 阅读提示：Methods中Immunoblotting和Tissue preparation, histology, immunohistochemistry小节 |