Tbkbp1在NKT细胞中的表达及敲除小鼠构建
确认Tbkbp1在NKT/NK细胞高表达并建立遗传工具。
qRT-PCR和免疫印迹检测Tbkbp1在胸腺和脾脏NKT、NK及常规T细胞中的表达；构建Tbkbp1全身敲除和T细胞条件性敲除小鼠。
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TBK结合蛋白1调节IL-15诱导的自噬和NKT细胞存活
TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival.
实验完整度
高包含Tbkbp1全身及T细胞条件性敲除小鼠、骨髓嵌合体、原代NKT/NK细胞、NKT杂交瘤、HEK293细胞及B16-OVA肿瘤模型，并开展自噬、凋亡、信号和机制验证。
主要模型
Tbkbp1全身敲除（Tbkbp1-KO）小鼠 T细胞条件性Tbkbp1敲除（Tbkbp1-TKO）小鼠 原代小鼠胸腺NKT细胞和脾NK细胞 NKT杂交瘤细胞系NKT1.2
重点核对
Tbkbp1-KO与Tbkbp1-TKO小鼠的NKT细胞频率、绝对数及CD44/NK1.1分期 IL-15刺激后LC3II生成、p62降解及Ulk1 S555磷酸化 Tbkbp1与FIP200/Ulk1及ANKRD28的共免疫沉淀相互作用 Tbkbp1 TBD结构域Q315和L319突变对Ulk1结合及自噬 rescue 的影响 B16-OVA肿瘤模型中CD8+ T细胞清除（anti-CD8α，150 μg/只）后的抗肿瘤效应
摘要
细胞因子IL-15介导免疫细胞的发育和存活，包括自然杀伤T（NKT）细胞，但IL-15功能的下游机制尚不完全清楚。在此，我们展示IL-15诱导NKT细胞自噬，其机制涉及一个关键信号组分——TBK结合蛋白1（Tbkbp1）。Tbkbp1通过拮抗mTORC1的抑制作用促进自噬起始激酶Ulk1的激活。这种拮抗作用涉及将一种拮抗mTORC1的磷酸酶招募到Ulk1。Tbkbp1缺陷减弱IL-15刺激的NKT细胞自噬，并与线粒体功能障碍、异常的ROS产生、Bcl2表达缺陷和NKT细胞存活减少相关。因此，Tbkbp1缺陷小鼠具有严重的NKT细胞缺陷，尤其是产生IFN-γ的NKT1细胞。我们进一步展示Tbkbp1调节IL-15刺激的NK细胞自噬和存活。这些发现提示了IL-15诱导自噬的机制，并确立了Tbkbp1作为NKT细胞发育和存活调节因子的地位。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-15如何诱导NKT细胞自噬并维持其存活，以及Tbkbp1在此过程中的作用。
- 核心机制
- IL-15刺激下，Tbkbp1通过与Ulk1-FIP200复合物结合并招募PP6磷酸酶至Ulk1，拮抗mTORC1对Ulk1 S757的抑制性磷酸化，促进AMPKα介导的Ulk1 S555磷酸化，从而诱导自噬。
- 主要证据
- Tbkbp1-KO和Tbkbp1-TKO小鼠显示NKT1细胞选择性丢失；原代NKT细胞和NKT1.2细胞中Tbkbp1缺失减弱IL-15诱导的LC3II生成、p62降解和Ulk1 S555磷酸化；Co-IP证实Tbkbp1与FIP200/Ulk1及ANKRD28相互作用；PP6亚基敲低增强Ulk1 S757磷酸化。
- 研究意义
- 提示IL-15诱导自噬的机制，并确立Tbkbp1作为NKT细胞发育和存活的调节因子，为免疫细胞发育和稳态中的自噬诱导提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Tbkbp1缺陷对NKT细胞数量和亚群的影响
确定Tbkbp1对NKT细胞发育和亚群维持的作用。
流式细胞术检测胸腺、脾脏和肝脏NKT细胞频率与绝对数、CD44/NK1.1分期、转录因子及IL-17Rb亚群；检测IFNγ和IL-4产生。
Tbkbp1细胞内在作用的骨髓嵌合体验证
区分Tbkbp1在NKT细胞中的细胞内在与外在作用。
将WT（CD45.1+）和Tbkbp1-KO（CD45.2+）骨髓细胞混合后过继转移至Rag1-KO受体，分析NKT细胞发育；检测DP胸腺细胞CD1d表达和抗原提呈功能。
Tbkbp1对IL-15诱导NKT细胞存活和Bcl-2表达的影响
验证Tbkbp1介导IL-15的促存活信号。
体外IL-15刺激NKT细胞，检测细胞扩增、AnnexinV/PI凋亡、CFSE增殖及Bcl-2蛋白和mRNA表达；并比较IL-2和IL-7的作用。
Tbkbp1缺陷导致线粒体ROS和线粒体功能异常
探究Tbkbp1缺失引起NKT细胞凋亡的下游事件。
流式检测ROS（CellROX Deep Red、MitoSOX）、线粒体质量和膜电位（MitoTracker Green、MitoTracker Red CMXRos）；用NAM处理检测对Bcl-2/Bcl-XL和凋亡的 rescue。
Tbkbp1介导IL-15诱导NKT细胞自噬
验证Tbkbp1在IL-15刺激自噬中的作用。
免疫印迹检测LC3II和p62、Ulk1 S555磷酸化；NKT1.2细胞shRNA敲低Tbkbp1；共聚焦检测LC3 puncta和线粒体-溶酶体共定位；自噬抑制剂3MA和bafilomycin A处理。
Tbkbp1与Ulk1-FIP200复合物相互作用及结构域定位
解析Tbkbp1调控自噬的分子结合基础。
Co-IP检测Tbkbp1与FIP200、Ulk1相互作用；构建Tbkbp1截短体和点突变体（Y298A、Q315A、L319A）确定结合结构域；在Tbkbp1敲低NKT1.2细胞中用突变体进行 rescue。
Tbkbp1拮抗mTORC1对Ulk1 S757的磷酸化
确定Tbkbp1调控Ulk1磷酸化开关的机制。
检测IL-15刺激后AMPKα和mTORC1活性、Ulk1 S555/S757磷酸化及Ulk1-AMPKα相互作用；使用mTOR抑制剂Torin和Tbkbp1过表达。
Tbkbp1招募PP6磷酸酶至Ulk1
验证Tbkbp1通过PP6拮抗mTORC1对Ulk1的磷酸化。
Co-IP检测Tbkbp1与ANKRD28、ANKRD28与Ulk1及内源性Ulk1-FIP200-Tbkbp1-ANKRD28复合物；shRNA敲低ANKRD28或PP6C后检测Ulk1 S757/S555磷酸化。
Tbkbp1对NK细胞自噬和存活的调控及体内抗肿瘤免疫
验证Tbkbp1在NK细胞中的作用及Tbkbp1-KO小鼠的抗肿瘤免疫表型。
检测脾脏NK细胞频率、CD11b/CD27分期、IL-15诱导的NK细胞存活和自噬；B16-OVA肿瘤模型检测肿瘤生长、生存及CD8+ T细胞清除后的抗肿瘤效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 定点突变 | QuickChange II定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| 质粒构建 | pcDNA-myc-Ulk1质粒 | Addgene | -- |
| p3xFLAG-FIP200质粒 | Addgene | -- | |
| 基因敲低 | pGIPZ慢病毒shRNA载体 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫印迹 | 抗磷酸化Akt抗体（9271） | Cell Signaling Technology | 9271 |
| 抗磷酸化Stat5抗体（9359） | Cell Signaling Technology | 9359 | |
| 抗Stat5抗体（9363） | Cell Signaling Technology | 9363 | |
| 抗α-Tubulin抗体（2144） | Cell Signaling Technology | 2144 | |
| 抗磷酸化Ulk1 Ser555抗体（5869） | Cell Signaling Technology | 5869 | |
| 抗磷酸化Ulk1 Ser467抗体（4634） | Cell Signaling Technology | 4634 | |
| 抗磷酸化Ulk1 Ser757抗体（14202） | Cell Signaling Technology | 14202 | |
| 抗Ulk1抗体（8054） | Cell Signaling Technology | 8054 | |
| 抗磷酸化AMPKα抗体（2535） | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 抗AMPKα抗体（5831） | Cell Signaling Technology | 5831 | |
| 抗磷酸化p70 S6K抗体（9206） | Cell Signaling Technology | 9206 | |
| 抗p70 S6K抗体（9202） | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 抗FIP200抗体（12436） | Cell Signaling Technology | 12436 | |
| 抗mTOR抗体（2972） | Cell Signaling Technology | 2972 | |
| 抗Tbkbp1抗体（8605） | Cell Signaling Technology | 8605 | |
| 抗Akt1抗体（sc-5298） | Santa Cruz Biotechnology | sc-5298 | |
| 抗c-Myc抗体（sc-40） | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗Ankrd28抗体（sc-393032） | Santa Cruz Biotechnology | sc-393032 | |
| 抗Hsp60抗体（sc-13115） | Santa Cruz Biotechnology | sc-13115 | |
| 抗PPP6C抗体（A300-844A） | Bethyl Laboratories, Inc. | A300-844A | |
| 辣根过氧化物酶标记抗HA抗体（3F10） | Roche | 3F10 | |
| 抗LC3抗体（L7543） | Sigma-Aldrich | L7543 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗Flag抗体（M2） | Sigma-Aldrich | M2 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗c-Myc抗体（MCA2200P） | Bio-Rad | MCA2200P | |
| 流式细胞术 | FITC Annexin-V凋亡检测试剂盒（556547） | BD Bioscience | 556547 |
| 自噬检测 | 线粒体自噬检测试剂盒（MD01-10） | Dojindo Molecular Technologies | MD01-10 |
| 细胞处理 | 烟酰胺（NAM；N0636） | Sigma-Aldrich | N0636 |
| 3-甲基腺嘌呤（3MA；M9281） | Sigma-Aldrich | M9281 | |
| 巴弗洛霉素A（B1793） | Sigma-Aldrich | B1793 | |
| 毒胡萝卜素（T9033） | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| DL-α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO；D193） | Sigma-Aldrich | D193 | |
| 细胞因子刺激 | 小鼠IL-2（402-ML） | R&D | 402-ML |
| 小鼠IL-7（407-ML） | R&D | 407-ML | |
| 小鼠IL-15（447-ML） | R&D | 447-ML | |
| 人IL-2（202-IL） | R&D | 202-IL | |
| 流式分析 | MitoTracker™ Green FM（M7514） | Thermo Fisher Scientific | M7514 |
| MitoSOX™ Red线粒体超氧化物指示剂（M36008） | Thermo Fisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker™ Red CMXRos（M7512） | Thermo Fisher Scientific | M7512 | |
| CellROX™ Deep Red流式细胞检测试剂盒（C10491） | Thermo Fisher Scientific | C10491 | |
| 共聚焦 | LysoTracker™ Deep Red（L12492） | Thermo Fisher Scientific | L12492 |
| 细胞内细胞因子染色 | 莫能菌素（00-4505-51） | eBioscience | 00-4505-51 |
| 细胞刺激 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（P1585） | Sigma-Aldrich | P1585 |
| 离子霉素（I0634） | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| 体内刺激 | α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer；KRN7000） | Avanti Polar Lipids | 867000 P |
| 流式分析 | 负载PBS57的小鼠CD1d四聚体 | NIH Tetramer Core Facility | -- |
| 共聚焦 | Alexa fluor 555山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | -- |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂（P36931） | Invitrogen | P36931 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Tbkbp1缺陷小鼠NKT细胞表型分析 | 小鼠周龄（6周）、每组n=6、NKT细胞鉴定用PBS57负载CD1d四聚体、未负载四聚体作阴性对照 阅读提示：Fig. 1c–e及图注；Methods中流式细胞术小节 |
| Tbkbp1-TKO和骨髓嵌合体分析 | 骨髓混合比例（WT:KO=1:4）、Rag1-KO受体照射剂量（950 rad）、重建时间（6周）、嵌合小鼠n=5 阅读提示：Fig. 2f, g及图注；Methods中BM adoptive transfer小节 |
| IL-15诱导NKT细胞存活和自噬 | IL-15刺激时间点、原代NKT细胞分选方法（CD1d四聚体磁珠富集并流式分选）、NKT1.2细胞shRNA敲低效率 阅读提示：Fig. 4a–g、Fig. 6a–e及图注；Methods中NKT and NK cell isolation and stimulation小节 |
| ROS和线粒体功能检测 | MitoTracker Green浓度（50 nM，30分钟）、MitoSOX浓度（2.5 μM，30分钟）、MitoTracker Red CMXRos浓度（100 nM，45分钟）、NAM处理时间（2天） 阅读提示：Fig. 5b–g及图注；Methods中Flow cytometry and intracellular cytokine staining小节 |
| B16-OVA肿瘤模型和CD8+ T细胞清除 | 肿瘤细胞接种量（5×10^5）、小鼠周龄（8周）、每组n=8、anti-CD8α剂量（150 μg/只）及给药日程（第-2、0、2、4、6、8、10天）、肿瘤大小终点（225 mm2） 阅读提示：Fig. 3e, f及图注；Methods中Tumor models小节 |