Sirtuin5 contributes to colorectal carcinogenesis by enhancing glutaminolysis in a deglutarylation-dependent manner.
含CRC组织/细胞系表达、体外敲低/过表达功能、代谢流、机制互作与去戊二酰化、裸鼠移植瘤体内验证
HCT116结直肠癌细胞系 LoVo结直肠癌细胞系 正常结肠上皮细胞FHC HCT116/LoVo裸鼠皮下移植瘤模型 84对CRC及癌旁正常组织
SIRT5 siRNA序列及转染浓度50 nM，使用Dharma FECT 1转染试剂 SIRT5 WT与催化失活突变体H158Y稳定表达细胞系构建及G418（1.5 mg/mL）筛选30天 GLUD1 siRNA敲低及GLUD1抑制剂EGCG（20 μM）阳性对照 [U-13C5]谷氨酰胺（2 mM）或[1-13C]谷氨酰胺标记24小时进行代谢流检测 裸鼠皮下注射5×10^6个CRC细胞，每2-3天测量肿瘤体积
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SIRT5在结直肠癌组织和细胞系中的表达水平及其与患者预后的关系。
免疫荧光组织化学检测84对CRC及癌旁正常组织中SIRT5蛋白表达和线粒体定位；分析GEO数据集（GSE 68468和GSE 41258）中SIRT5 mRNA水平；Western blot检测CRC细胞系和正常FHC细胞中SIRT5蛋白；Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析88例CRC患者SIRT5表达与临床病理特征及生存的关系。
评估SIRT5敲低对结直肠癌细胞增殖和存活的作用。
在HCT116和LoVo细胞中转染SIRT5 siRNA，CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测Annexin V凋亡和细胞周期，Western blot检测凋亡标志物和细胞周期调节因子。
验证SIRT5促增殖作用是否依赖其去酰化催化活性。
建立稳定表达空载体、SIRT5 WT或催化失活突变体SIRT5 H158Y的HCT116和LoVo细胞系，进行生长曲线和克隆形成实验。
确定SIRT5对CRC细胞代谢重编程，特别是谷氨酰胺进入TCA循环的影响。
SIRT5敲低HCT116细胞进行GC-MS代谢组学分析；LoVo细胞在[U-13C5]谷氨酰胺或[1-13C]谷氨酰胺中培养24小时，GC-MS检测同位素标记分布；检测谷氨酰胺消耗。
确定SIRT5调控的谷氨酰胺代谢关键酶及GLUD1的功能重要性。
检测SIRT5敲低或过表达后GLS、GLUD1、GOT1/2、GPT2、PSAT1蛋白水平及GLUD1、GLS、GOT2酶活性；谷氨酰胺剥夺培养基中补充DM glutamate、DM α-KG或NEAA；GLUD1 siRNA敲低和AOA处理；DM α-KG挽救实验。
阐明SIRT5激活GLUD1的分子机制。
免疫荧光共定位、共免疫沉淀、GST pull-down验证SIRT5与GLUD1直接相互作用；检测GLUD1戊二酰化、琥珀酰化、丙二酰化水平；体外戊二酰-CoA处理GLUD1检测酶活性；K399R、K503R、K545R突变体鉴定戊二酰化位点。
验证SIRT5在体内通过GLUD1促进结直肠癌肿瘤生长。
裸鼠皮下注射稳定表达空载体、SIRT5 WT、SIRT5 H158Y的HCT116细胞，或SIRT5过表达联合GLUD1 shRNA的LoVo细胞，或SIRT5 shRNA敲低的HCT116细胞；测量肿瘤体积和重量，检测肿瘤组织GLUD1酶活性和代谢物。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Gibco BRL | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco BRL | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco BRL | -- | |
| 无谷氨酰胺RPMI 1640 | Gibco BRL | -- | |
| 透析胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 药物处理 | 二甲基-α-酮戊二酸 | Sigma-Aldrich | 349631 |
| 天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| 天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | 4159 | |
| 氨基氧乙酸 | Sigma-Aldrich | C13408 | |
| 表没食子儿茶素没食子酸酯 | Sigma-Aldrich | 4143 | |
| 二甲基-谷氨酸 | Tokyo Chemical Industry | D3305 | |
| siRNA转染 | Dharma FECT 1转染试剂 | Dharmacon | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 流式分析 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Pharmingen | -- |
| 稳定细胞系构建 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- |
| 稳定细胞系筛选 | G418 | MP Biomedicals | -- |
| Western blot | 抗SIRT5抗体 | Sigma-Aldrich | HPA022002 |
| 抗cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 抗cleaved caspase 8抗体 | Cell Signaling Technology | 9496 | |
| 抗cleaved caspase 6抗体 | Cell Signaling Technology | 9761 | |
| 抗cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| 抗γ-H2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| 抗CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 | |
| 抗cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| 抗cyclin D3抗体 | Cell Signaling Technology | 2936 | |
| 抗cyclin A2抗体 | Cell Signaling Technology | 4656 | |
| 抗cyclin B1抗体 | Cell Signaling Technology | 12231 | |
| 抗cyclin E1抗体 | Cell Signaling Technology | 20808 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗α-tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 2148 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Covance | MMS-101P | |
| 抗GLUD1抗体 | Proteintech | 14299-1-AP | |
| 抗GOT2抗体 | Proteintech | 14800-1-AP | |
| 抗GPT2抗体 | Proteintech | 16757-1-AP | |
| 抗GLS抗体 | Proteintech | 12855-1-AP | |
| 抗PSAT1抗体 | Proteintech | 10501-1-AP | |
| 抗GOT1抗体 | Proteintech | 14886-1-AP | |
| 抗泛琥珀酰化抗体 | PTM Biolabs | PTM-401 | |
| 抗泛戊二酰化抗体 | PTM Biolabs | PTM-1151 | |
| 抗泛丙二酰化抗体 | PTM Biolabs | PTM-901 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔二抗 | Kangcheng | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记抗鼠二抗 | Kangcheng | -- | |
| Western ECL底物 | Thermo Scientific | -- | |
| 酶活性测定 | 谷氨酸脱氢酶活性比色测定试剂盒 | BioVision | K729-100 |
| 谷草转氨酶活性测定试剂盒 | BioVision | K753-100 | |
| 谷氨酰胺酶测定试剂盒 | Biomedical Research Service Center | E-133 | |
| 代谢物检测 | 谷氨酰胺测定试剂盒 | Bioassay Systems | EGLN-100 |
| 代谢物衍生化 | 甲氧胺 | -- | -- |
| 代谢组学分析 | Agilent 7890A气相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent 5975C惰性MSD系统 | Agilent Technologies | -- | |
| HP-5ms熔融石英毛细管柱 | Agilent J&W Scientific | -- | |
| 同位素示踪 | [U-13C5]谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | -- |
| [1-13C]谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 免疫荧光 | 抗线粒体抗体 | Abcam | ab3298 |
| 驴抗鼠Dylight 488二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 驴抗兔Dylight 594二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa 488标记抗兔二抗 | -- | -- | |
| 2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-甲脒 | -- | -- | |
| 共免疫沉淀 | Pierce共免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26149 |
| GST pull-down | 谷胱甘肽-琼脂糖4B珠 | GE Healthcare | -- |
| 抗His抗体 | CMCTAG | -- | |
| 抗GST抗体 | CMCTAG | -- | |
| RNA提取与逆转录 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | 第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | -- |
| 实时定量PCR | SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| ABI Prism 7900HT序列检测系统 | Applied Biosystems | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HCT116和LoVo细胞培养基分别为McCoy's 5A和RPMI 1640补充10% FBS；谷氨酰胺剥夺使用无谷氨酰胺RPMI 1640补充10%透析FBS；药物浓度：DM-α-KG 1 mM、DM glutamate 10 mM、EGCG 20 μM、AOA浓度文中未明确说明 阅读提示：Methods 'Cell culture'小节 |
| SIRT5敲低与过表达 | SIRT5 siRNA序列及转染浓度50 nM；SIRT5 WT和H158Y突变体稳定细胞系筛选使用G418 1.5 mg/mL培养30天 阅读提示：Methods 'RNA interference'和'Stable cell line generation'小节 |
| 13C代谢流实验 | LoVo细胞在含2 mM [U-13C5]谷氨酰胺或[1-13C]谷氨酰胺的无谷氨酰胺RPMI 1640中培养24小时；HCT116细胞1×10^7/样本、LoVo细胞2×10^6/样本用于GC-MS 阅读提示：Methods 'Metabolite-level measurements'小节 |
| GLUD1酶活与戊二酰化检测 | GLUD1活性使用Glutamate Dehydrogenase Activity Colorimetric Assay Kit（K729-100）；体外戊二酰化反应使用戊二酰-CoA 0、1、2 mM，37°C孵育60分钟；K399R、K503R、K545R突变体转染HCT116后SIRT5敲低 阅读提示：Methods 'Enzyme activity measurements'和'Immunoprecipitation and GST pull-down experiments'小节及Fig. 6图注 |
| 裸鼠移植瘤实验 | 裸鼠（nu/nu，雄性，5周龄），皮下注射5×10^6个细胞；SIRT5 WT组n=9，GLUD1 shRNA组n=6；每2-3天测量肿瘤直径，体积计算公式：(最短直径)^2×(最长直径)×0.5 阅读提示：Methods 'In vivo models'小节及Fig. 7图注 |
