正交诱导干细胞分化,用于血管化类器官和生物打印组织的程序化图案化

Orthogonally induced differentiation of stem cells for the programmatic patterning of vascularized organoids and bioprinted tissues

作者信息Mark A Skylar-Scott, Jeremy Y Huang, Aric Lu, Alex H M Ng, Tomoya Duenki, Songlei Liu, Lucy L Nam, Sarita Damaraju, George M Church, Jennifer A Lewis
PMID35332307
发布时间2022-04
DOI10.1038/s41551-022-00856-8

实验完整度

包含二维分化验证、共培养实验、类器官模型、单细胞RNA测序和生物打印组织等多层级实验,并进行了功能验证和机制验证。

主要模型

PGP1人诱导多能干细胞系(野生型和诱导型TF细胞系) 血管化皮质类器官(随机混合和多核壳结构) 生物打印三维神经组织

重点核对

培养基组成(NIM或内皮指定培养基)对OID的影响 多西环素浓度(500 ng ml−1)及时长(6天)对分化效率的影响 细胞比例(如WT:iEndo=2:1)对类器官血管化的影响 打印参数(喷嘴直径50μm和100μm,速度最高20 mm s−1)对细胞活性的影响 细胞系特异性(iEndo过表达ETV2,iNeuron过表达NGN1)

摘要

能够同时将人诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为不同细胞类型,将有助于生成具有可编程细胞复杂性、结构和功能的类器官和组织。然而,通过过表达特定转录因子进行分化的方案通常只产生单一细胞类型。在这里,我们展示了通过强制过表达转录因子,独立于培养基成分,同时共分化hiPSCs为不同细胞类型,可以生成具有受控组成和组织的图案化类器官和生物打印组织。具体来说,我们使用这种正交诱导分化,在含有神经或内皮干细胞指定培养基的一锅系统中,从hiPSCs生成内皮细胞和神经元,并通过将诱导型转录因子和野生型hiPSCs聚集成随机混合或多核壳胚胎体,在数天内产生血管化和图案化的皮质类器官。此外,通过利用无细胞外基质的hiPSC墨水进行多材料生物打印,我们生成了由神经干细胞、内皮和神经元组成的层状区域的图案化神经组织。干细胞的正交诱导分化可能有助于制造用于生物医学应用的工程组织。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
能否通过正交诱导分化(OID),在不依赖培养基成分的情况下,同时将hiPSCs分化为多种细胞类型,并用于构建血管化类器官和图案化生物打印组织?
核心机制
过表达特定转录因子(ETV2驱动内皮分化,NGN1驱动神经元分化)可压倒培养基驱动的分化信号,实现独立于细胞外信号的细胞内命运决定,从而在共培养中保持细胞身份。
主要证据
二维共培养实验显示,在多西环素存在下,iEndo细胞分化为内皮细胞(99%),iNeuron细胞分化为神经元,而野生型细胞在神经诱导培养基中分化为神经干细胞;类器官和生物打印实验进一步证实了该方法的可行性。
研究意义
OID方法可快速、高效、可扩展地生成含多种细胞类型的类器官和3D组织,为药物筛选、疾病建模和治疗应用提供新途径。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

二维OID验证

验证过表达转录因子能否独立于培养基驱动细胞分化

将野生型、iEndo和iNeuron hiPSCs在相同培养基(NIM)中培养,加入或不加入多西环素,6天后通过免疫染色和流式细胞术检测分化标志物。

2

共培养OID验证

测试同时分化多种细胞类型的能力及细胞间相互作用

将不同比例的WT、iEndo和iNeuron细胞混合培养在NIM中,加入多西环素,观察分化后的细胞组成和形态。

3

血管化皮质类器官构建

通过OID生成含有血管网络的皮质类器官

将WT和iEndo细胞以不同比例(如2:1)混合形成胚胎体,培养在神经诱导培养基中,然后包埋于Matrigel/胶原凝胶中,观察血管网络形成。

4

多核壳皮质类器官构建

构建具有空间图案的皮质类器官

通过分步添加WT、iNeuron和iEndo细胞到V形孔板中形成多核壳胚胎体,然后进行神经诱导和培养,观察分层结构。

5

3D生物打印

利用OID生成图案化的3D神经组织

将WT、iEndo和iNeuron细胞制成高密度无基质墨水,通过多材料喷嘴打印成多层结构,包裹在明胶-纤维蛋白原凝胶中,加入多西环素诱导分化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
mTeSR1培养基STEMCELL Technologies05850
基质胶Corning354277
基质胶(生长因子减少型)Corning354230
TrypLE Express酶Life Technologies12604013
Y-27632Selleck ChemicalsS1049
mFreSRSTEMCELL Technologies05854
PiggyBac载体----
Gateway LR Clonase II 酶混合物Invitrogen12538200
Super PiggyBac转座酶表达载体SBIPB210PA-1
Lonza 4D核转染仪X单元LonzaAAF-1002X
P3溶液试剂盒LonzaV4XP-3032
嘌呤霉素GibcoA1113803
细胞过滤器(35 μm)Falcon352235
SH800S细胞分选仪Sony--
CloneRSTEMCELL Technologies05888
多西环素盐酸盐MilliporeSigmaD9891
FUGW质粒Addgene14883
Opti-MEM I培养基ThermoFisher319850672
pCMV-VSV-G包膜质粒Addgene8454
psPAX2包装质粒Addgene12260
FuGene6转染试剂PromegaE2691
Lenti-X浓缩器Takara Bio631231
DMEM/F12培养基Gibco10565018
N2添加剂Gibco17502048
MEM非必需氨基酸Gibco11140050
肝素SigmaH3149
SB431542BioGems3014193
LDN193189BioGems1066208
RPMI 1640培养基Gibco11875093
B27无胰岛素添加剂GibcoA1895601
CHIR99021BioGems2520691
EGM-2培养基PromoCellC-22111
血管内皮生长因子PeproTech100-20
成纤维细胞生长因子2PeproTech100-18B
BD Cytofix固定液BD554714
牛血清白蛋白MilliporeSigmaA305
BD Perm/Wash缓冲液BD554723
BD抗小鼠免疫球蛋白BD552843
BD LSRFortessa流式细胞仪BD--
Ambion PureLink RNA小提试剂盒Invitrogen12183025
低起始量RNA试剂盒Takara634894
NovaSeq 6000测序仪Illumina--
温和细胞解离试剂STEMCELL Technologies07174
含HEPES的DMEM/F12培养基Gibco11330032
聚乙烯醇MilliporeSigmaP8136
AggreWell 400板STEMCELL Technologies34411
AggreWell 800板STEMCELL Technologies34815
EDTA解离试剂----
I型胶原蛋白(大鼠尾)Corning354249
OCT包埋剂Tissue-Tek4583
Triton-XMilliporeSigmaT8787
驴血清MilliporeSigmaD9663
吐温-20MilliporeSigmaP9416
DAPI----
EasyIndexLifeCanvas TechnologiesEI-Z1001
SuperScript IV第一链合成系统Invitrogen18091050
PrimeTime qPCR探针IDT--
PrimeTime基因表达预混液IDT1055771
BioRad CFX96 qPCR仪BioRad--
Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒10x GenomicsPN-1000127
Chromium Next GEM单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3.010x GenomicsPN-1000128
10x Chromium控制器10x GenomicsPN-1000202
Qubit dsDNA HS检测试剂盒ThermoFisher ScientificQ32854
Agilent高灵敏度DNA分析试剂盒Agilent5067-4626
Agilent 2100生物分析仪AgilentG2939BA
Single Index Kit T Set A10x GenomicsPN-1000213
CellTracker Green CMFDAMolecular ProbesC7025
CellTracker Orange CMTMRMolecular ProbesC2927
CellTracker Deep RedMolecular ProbesC34565
CellTracker Blue CMACMolecular ProbesC2110
CellTracker Red CMTPXMolecular ProbesC34552
Fusion360Autodesk--
Perfactory AureusEnvisionTEC--
HTM140v2树脂EnvisionTEC--
Omnicure UV灯EXFO--
1毫升注射器Covidien Kendall8881901014
250微升气密玻璃注射器Hamilton81120
锥形金属喷嘴(50 μm)GPD Global10/4794
锥形金属喷嘴(100 μm)GPD Global10/4793
TranswellGreiner Bio-One657641
明胶MilliporeSigmaG2500
纤维蛋白原MilliporeSigma341576
凝血酶MilliporeSigmaT4648
抑肽酶----
细胞计数器InvitrogenAMQAX1000
LIVE/DEAD活/死细胞毒性试剂盒InvitrogenL3224
抗生素-抗真菌剂Gibco15240062

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
hiPSC细胞系:PGP1(Coriell, GM23338),培养代数20-50;培养基:mTeSR1;基质胶包被
阅读提示:Methods: Cell culture
二维分化
多西环素浓度:500 ng ml−1;培养时间:6天;细胞接种密度:300,000细胞/孔(6孔板)
阅读提示:Methods: Two-dimensional OID assays
血管化皮质类器官
细胞比例:WT:iEndo = 2:1;胚胎体形成:AggreWell 800板;神经诱导培养基NIM;包埋凝胶:4 mg/ml胶原蛋白I和25% Matrigel;培养时间:最长45天
阅读提示:Methods: Vascularized cortical organoid culture
多核壳皮质类器官
V形孔板;细胞添加顺序:WT(1000细胞)→ iNeuron(2000细胞)→ iEndo(2000细胞);培养时间:10天
阅读提示:Methods: Multicore-shell cortical organoid culture
3D生物打印
细胞密度:>5×10^8细胞/ml;喷嘴直径:50μm和100μm;打印速度:最高20 mm/s;凝胶包裹:明胶-纤维蛋白原;培养时间:6天
阅读提示:Methods: Three-dimensional bioprinting