二维OID验证
验证过表达转录因子能否独立于培养基驱动细胞分化
将野生型、iEndo和iNeuron hiPSCs在相同培养基(NIM)中培养,加入或不加入多西环素,6天后通过免疫染色和流式细胞术检测分化标志物。
Orthogonally induced differentiation of stem cells for the programmatic patterning of vascularized organoids and bioprinted tissues
包含二维分化验证、共培养实验、类器官模型、单细胞RNA测序和生物打印组织等多层级实验,并进行了功能验证和机制验证。
PGP1人诱导多能干细胞系(野生型和诱导型TF细胞系) 血管化皮质类器官(随机混合和多核壳结构) 生物打印三维神经组织
培养基组成(NIM或内皮指定培养基)对OID的影响 多西环素浓度(500 ng ml−1)及时长(6天)对分化效率的影响 细胞比例(如WT:iEndo=2:1)对类器官血管化的影响 打印参数(喷嘴直径50μm和100μm,速度最高20 mm s−1)对细胞活性的影响 细胞系特异性(iEndo过表达ETV2,iNeuron过表达NGN1)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证过表达转录因子能否独立于培养基驱动细胞分化
将野生型、iEndo和iNeuron hiPSCs在相同培养基(NIM)中培养,加入或不加入多西环素,6天后通过免疫染色和流式细胞术检测分化标志物。
测试同时分化多种细胞类型的能力及细胞间相互作用
将不同比例的WT、iEndo和iNeuron细胞混合培养在NIM中,加入多西环素,观察分化后的细胞组成和形态。
通过OID生成含有血管网络的皮质类器官
将WT和iEndo细胞以不同比例(如2:1)混合形成胚胎体,培养在神经诱导培养基中,然后包埋于Matrigel/胶原凝胶中,观察血管网络形成。
构建具有空间图案的皮质类器官
通过分步添加WT、iNeuron和iEndo细胞到V形孔板中形成多核壳胚胎体,然后进行神经诱导和培养,观察分层结构。
利用OID生成图案化的3D神经组织
将WT、iEndo和iNeuron细胞制成高密度无基质墨水,通过多材料喷嘴打印成多层结构,包裹在明胶-纤维蛋白原凝胶中,加入多西环素诱导分化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | 05850 |
| 基质胶 | Corning | 354277 | |
| 基质胶(生长因子减少型) | Corning | 354230 | |
| TrypLE Express酶 | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05854 | |
| 细胞转染 | PiggyBac载体 | -- | -- |
| Gateway LR Clonase II 酶混合物 | Invitrogen | 12538200 | |
| Super PiggyBac转座酶表达载体 | SBI | PB210PA-1 | |
| Lonza 4D核转染仪X单元 | Lonza | AAF-1002X | |
| P3溶液试剂盒 | Lonza | V4XP-3032 | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 |
| 细胞培养 | 细胞过滤器(35 μm) | Falcon | 352235 |
| 细胞分选 | SH800S细胞分选仪 | Sony | -- |
| 细胞培养 | CloneR | STEMCELL Technologies | 05888 |
| 细胞诱导 | 多西环素盐酸盐 | MilliporeSigma | D9891 |
| 细胞标记 | FUGW质粒 | Addgene | 14883 |
| 细胞培养 | Opti-MEM I培养基 | ThermoFisher | 319850672 |
| 病毒包装 | pCMV-VSV-G包膜质粒 | Addgene | 8454 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| FuGene6转染试剂 | Promega | E2691 | |
| 病毒浓缩 | Lenti-X浓缩器 | Takara Bio | 631231 |
| 二维分化 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 10565018 |
| N2添加剂 | Gibco | 17502048 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 肝素 | Sigma | H3149 | |
| SB431542 | BioGems | 3014193 | |
| LDN193189 | BioGems | 1066208 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| B27无胰岛素添加剂 | Gibco | A1895601 | |
| CHIR99021 | BioGems | 2520691 | |
| EGM-2培养基 | PromoCell | C-22111 | |
| 血管内皮生长因子 | PeproTech | 100-20 | |
| 成纤维细胞生长因子2 | PeproTech | 100-18B | |
| 流式细胞术 | BD Cytofix固定液 | BD | 554714 |
| 牛血清白蛋白 | MilliporeSigma | A305 | |
| BD Perm/Wash缓冲液 | BD | 554723 | |
| BD抗小鼠免疫球蛋白 | BD | 552843 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| RNA测序 | Ambion PureLink RNA小提试剂盒 | Invitrogen | 12183025 |
| 低起始量RNA试剂盒 | Takara | 634894 | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 类器官培养 | 温和细胞解离试剂 | STEMCELL Technologies | 07174 |
| 含HEPES的DMEM/F12培养基 | Gibco | 11330032 | |
| 聚乙烯醇 | MilliporeSigma | P8136 | |
| AggreWell 400板 | STEMCELL Technologies | 34411 | |
| AggreWell 800板 | STEMCELL Technologies | 34815 | |
| EDTA解离试剂 | -- | -- | |
| I型胶原蛋白(大鼠尾) | Corning | 354249 | |
| 免疫染色 | OCT包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 |
| Triton-X | MilliporeSigma | T8787 | |
| 驴血清 | MilliporeSigma | D9663 | |
| 吐温-20 | MilliporeSigma | P9416 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 组织透明化 | EasyIndex | LifeCanvas Technologies | EI-Z1001 |
| RT-qPCR | SuperScript IV第一链合成系统 | Invitrogen | 18091050 |
| PrimeTime qPCR探针 | IDT | -- | |
| PrimeTime基因表达预混液 | IDT | 1055771 | |
| BioRad CFX96 qPCR仪 | BioRad | -- | |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000127 |
| Chromium Next GEM单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3.0 | 10x Genomics | PN-1000128 | |
| 10x Chromium控制器 | 10x Genomics | PN-1000202 | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Q32854 | |
| Agilent高灵敏度DNA分析试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | G2939BA | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| 细胞标记 | CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Orange CMTMR | Molecular Probes | C2927 | |
| CellTracker Deep Red | Molecular Probes | C34565 | |
| CellTracker Blue CMAC | Molecular Probes | C2110 | |
| CellTracker Red CMTPX | Molecular Probes | C34552 | |
| 3D生物打印 | Fusion360 | Autodesk | -- |
| Perfactory Aureus | EnvisionTEC | -- | |
| HTM140v2树脂 | EnvisionTEC | -- | |
| Omnicure UV灯 | EXFO | -- | |
| 1毫升注射器 | Covidien Kendall | 8881901014 | |
| 250微升气密玻璃注射器 | Hamilton | 81120 | |
| 锥形金属喷嘴(50 μm) | GPD Global | 10/4794 | |
| 锥形金属喷嘴(100 μm) | GPD Global | 10/4793 | |
| Transwell | Greiner Bio-One | 657641 | |
| 明胶 | MilliporeSigma | G2500 | |
| 纤维蛋白原 | MilliporeSigma | 341576 | |
| 凝血酶 | MilliporeSigma | T4648 | |
| 抑肽酶 | -- | -- | |
| 细胞计数 | 细胞计数器 | Invitrogen | AMQAX1000 |
| 活/死检测 | LIVE/DEAD活/死细胞毒性试剂盒 | Invitrogen | L3224 |
| 细胞培养 | 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | hiPSC细胞系:PGP1(Coriell, GM23338),培养代数20-50;培养基:mTeSR1;基质胶包被 阅读提示:Methods: Cell culture |
| 二维分化 | 多西环素浓度:500 ng ml−1;培养时间:6天;细胞接种密度:300,000细胞/孔(6孔板) 阅读提示:Methods: Two-dimensional OID assays |
| 血管化皮质类器官 | 细胞比例:WT:iEndo = 2:1;胚胎体形成:AggreWell 800板;神经诱导培养基NIM;包埋凝胶:4 mg/ml胶原蛋白I和25% Matrigel;培养时间:最长45天 阅读提示:Methods: Vascularized cortical organoid culture |
| 多核壳皮质类器官 | V形孔板;细胞添加顺序:WT(1000细胞)→ iNeuron(2000细胞)→ iEndo(2000细胞);培养时间:10天 阅读提示:Methods: Multicore-shell cortical organoid culture |
| 3D生物打印 | 细胞密度:>5×10^8细胞/ml;喷嘴直径:50μm和100μm;打印速度:最高20 mm/s;凝胶包裹:明胶-纤维蛋白原;培养时间:6天 阅读提示:Methods: Three-dimensional bioprinting |