单细胞转录组图谱构建与细胞分群
表征NKTCL肿瘤与对照组织的细胞组成和异质性
对NKTCL患者肿瘤组织及非恶性鼻咽组织对照进行单细胞RNA测序，质控后保留96369个细胞，基于经典标记基因鉴定八种主要细胞类型及增殖细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
单细胞和空间转录组学揭示自然杀伤/T细胞淋巴瘤的瘤内异质性和免疫逃逸
Single-cell and spatial transcriptomics reveal intratumor heterogeneity and immune evasion in natural killer/T cell lymphoma.
实验完整度
高包含单细胞RNA测序、空间转录组、WES、细胞系实验、异种移植模型及功能验证（FABP5过表达/敲低/抑制剂）与机制验证（Co-IP）
主要模型
NKTCL患者肿瘤组织（13例） 非恶性鼻咽组织对照（7例） YT和NKYS细胞系 BALB/c裸鼠YT细胞异种移植模型
重点核对
单细胞RNA测序样本量：10例原发NKTCL及2例配对治疗后样本，对照7例非恶性鼻咽组织 FABP5抑制剂SBFI-26体外浓度：50 μM或100 μM；体内剂量：4 mg/kg每日腹腔注射，持续14天 YT细胞过表达FABP5或对照，转染后48小时检测 FABP5敲低使用两条独立siRNA（si-FABP5#1和si-FABP5#2），转染后48小时检测 Co-IP使用HEK293T细胞共转染Flag-FABP5和HA-c-Myc，48小时后用抗Flag磁珠免疫沉淀
摘要
自然杀伤/T细胞淋巴瘤（NKTCL）是一种与EB病毒相关的高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤亚型。然而，瘤内异质性及肿瘤微环境（TME）内的相互作用仍未被充分了解。在此，我们利用单细胞和空间转录组学分析NKTCL患者的组织，鉴定出五个具有不同功能通路、分化轨迹和空间分布的恶性元程序（MPs）。值得注意的是，MP3亚群出现在肿瘤分化的早期阶段，其特征是MYC信号通路的过度激活并与不良预后相关。有趣的是，脂肪酸结合蛋白5（FABP5）的药理学抑制导致c-Myc下调，并在体外和体内显著损害肿瘤生长。此外，配体-受体相互作用分析揭示肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可能促进免疫逃逸并在TME中抑制T细胞活性。总之，我们的发现阐明了NKTCL的细胞异质性和免疫景观，为治疗干预提供了潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NKTCL的瘤内异质性、空间架构以及肿瘤微环境中恶性细胞与免疫细胞的相互作用如何？
- 核心机制
- FABP5通过稳定c-Myc蛋白正调控MYC信号通路，促进NKTCL细胞增殖；肿瘤相关巨噬细胞（特别是APOE+巨噬细胞）可能通过SIRPα-CD47等配体-受体相互作用抑制T细胞活性并促进免疫逃逸。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定出五种恶性元程序，MP3亚群富集MYC靶基因和脂肪酸代谢且与不良预后相关；FABP5过表达促进YT细胞增殖，SBFI-26抑制细胞生长并下调c-Myc，在YT异种移植模型中抑制肿瘤生长；Co-IP显示FABP5与c-Myc物理结合；空间转录组显示MP3肿瘤细胞与APOE+巨噬细胞空间共定位，配体-受体分析提示SIRPα-CD47和CCL5-CCR1等相互作用。
- 研究意义
- 阐明了NKTCL的细胞异质性和免疫景观，提示FABP5作为MYC驱动NKTCL的潜在治疗靶点，并揭示巨噬细胞介导的免疫逃逸是TME的关键特征，为分子和免疫治疗干预提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
恶性细胞鉴定与瘤内异质性分析
区分恶性与非恶性细胞并解析恶性细胞的表达程序
利用inferCNV从转录组数据推断染色体拷贝数变异以定义恶性细胞，对7例含丰富恶性细胞的肿瘤应用cNMF鉴定37个瘤内程序并聚类为5个元程序（MP1-MP5），进行通路富集和预后关联分析。
分化轨迹与FABP5功能验证
探究恶性细胞分化状态及FABP5在NKTCL细胞增殖和MYC信号中的作用
使用monocle2和CytoTRACE分析恶性细胞分化轨迹；在YT细胞中过表达FABP5或使用SBFI-26抑制FABP5，通过CCK-8检测增殖；通过Western blot和Co-IP检测c-Myc表达及FABP5-c-Myc相互作用。
体内异种移植模型验证
评估FABP5抑制对NKTCL肿瘤生长的影响
将YT细胞皮下注射至BALB/c裸鼠建立异种移植瘤，每日腹腔注射SBFI-26或玉米油对照，监测肿瘤体积和重量，并进行Ki67、cleaved Caspase-3和c-Myc免疫组化染色。
空间转录组与细胞邻域分析
解析恶性细胞与免疫细胞的空间分布和相互作用
对3例原发NKTCL样本进行Stereo-seq空间转录组分析，使用SPOTlight解卷积bin50 spot的细胞类型组成，进行细胞邻域（CN）分析和配体-受体相互作用分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31870082 |
| IMDM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | SBFI-26 | Selleck | S9957; CAS:1541209-75-9 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| Western blot | 兔单克隆抗FABP5抗体 | Abcam | ab255276 |
| 鼠单克隆抗c-Myc抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA1-16637 | |
| 兔单克隆抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 兔单克隆抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | ZSGB Bio | ZM-0167 |
| 兔多克隆抗cleaved Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG® M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| IP裂解液 | Beyotime | P0013 | |
| Western blot | RIPA裂解液（10×） | Millipore | 20-188 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78441 | |
| 蛋白质定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 |
| 细胞增殖检测 | Cell Counting Kit-8细胞增殖检测试剂盒 | APExBIO | K1018 |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3.1 | 10X Genomics | 1000121 |
| 全外显子组测序 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 人全外显子1.0试剂盒 | Shbio | ShY1001B | |
| 空间转录组 | Stereo-seq芯片v1.2 | BGI Shenzhen | 201ST114 |
| 动物实验 | 玉米油 | -- | -- |
| 细胞培养 | 白细胞介素-2 | -- | -- |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 样本来源：13例NKTCL患者（10例原发，2例配对治疗后），对照7例非恶性鼻咽组织；质控标准：基因数>700，UMI>1000，线粒体基因比例<20%；测序深度>33000 reads/细胞 阅读提示：STAR Methods中Single-cell RNA sequencing小节；Table S1 |
| 空间转录组分析 | 样本：3例原发NKTCL；bin大小：50×50 DNB bins（25 μm直径）；质控后保留27129个spot；解卷积软件：SPOTlight v1.5.1 阅读提示：STAR Methods中Spatial transcriptomics小节；Figure 5 |
| FABP5体外功能实验 | 细胞系：YT和NKYS；SBFI-26浓度：50 μM或100 μM；过表达/敲低后检测时间：48小时；siRNA序列见Key Resources Table 阅读提示：STAR Methods中Cell proliferation assay、FABP5 knockdown and overexpression小节；Figure 3 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠：雌性BALB/c裸鼠4-5周龄，18-20 g；细胞接种量：1×10^7 YT细胞/只；给药：SBFI-26 4 mg/kg每日腹腔注射，持续14天；分组n=5/组；对照：玉米油 阅读提示：STAR Methods中Xenograft tumor model小节；Figure 3C |
| Co-IP实验 | 细胞：HEK293T；质粒：pCAGGS-CMV-FABP5-FLAG和pCAGGS-CMV-c-Myc-HA共转染；转染试剂Lipofectamine RNAiMAX；48小时后裂解；免疫沉淀：抗Flag磁珠（Sigma-Aldrich M8823） 阅读提示：STAR Methods中Co-immunoprecipitation (Co-IP)小节；Figure 3G |