小鼠肺IRI模型建立与单细胞转录组图谱构建
解析肺IRI中免疫细胞组成及中性粒细胞异质性
对小鼠左肺门夹闭1 h再灌注3 h的肺组织及假手术对照进行scRNA-seq，鉴定免疫细胞亚群和差异表达基因，发现LAN3（Cd177+）亚群在IRI中显著增加。
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靶向CD177+中性粒细胞的线粒体复合物I减轻肺缺血再灌注损伤
Targeting mitochondrial complex I of CD177+ neutrophils alleviates lung ischemia-reperfusion injury.
实验完整度
高scRNA-seq、Stereo-seq、蛋白组、体外功能、Cd177敲除小鼠IRI及大鼠肺移植多层级验证
主要模型
小鼠左肺门夹闭缺血再灌注模型 大鼠原位左肺移植模型 人肺移植受者外周血样本 CD177+/-人中性粒细胞及Cd177条件敲除小鼠骨髓中性粒细胞
重点核对
CD177+中性粒细胞通过CD177/MAC-1-ILK-AKT/mTOR轴上调线粒体复合物I并增强OXPHOS Cd177中性粒细胞特异性敲除减轻小鼠肺IRI损伤和NET形成 ΔCD177+中性粒细胞预测 grade 3 PGD的AUC=0.871（95% CI 0.764–0.951） IACS-010759（1 mg/kg，术前3 h尾静脉注射）减轻小鼠和大鼠肺损伤 人CD177+中性粒细胞ROS和NET形成高于CD177−中性粒细胞（n=5/组）
摘要
原发性移植物功能障碍（PGD）是肺移植术后早期发病和死亡的主要原因，中性粒细胞在其炎症病理中起核心作用。本研究采用单细胞RNA测序和空间转录组学探究肺缺血再灌注损伤（IRI）模型中的中性粒细胞亚型。我们鉴定出CD177+中性粒细胞是一个活化亚群，显著促进肺损伤，并可作为预测人肺移植受者严重PGD的早期生物标志物（曲线下面积[AUC]=0.871）。CD177+中性粒细胞表现出氧化磷酸化升高和线粒体复合物I活性增加，驱动炎症和中性粒细胞胞外诱捕网形成。使用复合物I抑制剂IACS-010759靶向线粒体功能可减少CD177+中性粒细胞活化，并在小鼠IRI和大鼠左肺移植模型中减轻肺损伤。这些发现提供了肺IRI中CD177+中性粒细胞驱动炎症的全面景观，并突显了其未来早期诊断和治疗干预的潜在价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺缺血再灌注损伤中是否存在特定的中性粒细胞亚群驱动损伤，其分子机制是什么，能否作为严重原发性移植物功能障碍的早期诊断标志物和治疗靶点？
- 核心机制
- CD177/MAC-1复合物通过ILK激活AKT/mTOR信号，上调线粒体复合物I基因转录并增强氧化磷酸化，驱动CD177+中性粒细胞活化和NET形成。
- 主要证据
- scRNA-seq和Stereo-seq鉴定IRI肺中Cd177+中性粒细胞亚群；Cd177中性粒细胞特异性敲除小鼠减轻肺损伤和NET浸润；人CD177+中性粒细胞蛋白组、OCR和蓝白非变性电泳显示复合物I活性升高；IACS-010759在小鼠IRI和大鼠左肺移植模型中减轻肺损伤；104例肺移植受者队列显示ΔCD177+中性粒细胞预测grade 3 PGD的AUC=0.871。
- 研究意义
- 本研究揭示了CD177+中性粒细胞驱动肺IRI炎症的机制，提示其作为严重PGD早期诊断标志物和靶向线粒体复合物I治疗策略的潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组验证Cd177+中性粒细胞的空间分布
在空间维度验证scRNA-seq鉴定的Cd177+中性粒细胞亚群及其炎症特征
对小鼠IRI肺切片进行Stereo-seq，基于核酸染色图像进行单细胞分割，分析Cd177与炎症基因Ltf、Pglyrp1的空间共表达，并比较Cd177+与Cd177−中性粒细胞的基因富集。
CD177+中性粒细胞功能验证（ROS和NET形成）
验证CD177+中性粒细胞是否具有更强的ROS产生和NET形成能力
分选人CD177+与CD177−中性粒细胞及Cd177flox/flox与Cd177flox/flox; Ly6gCre小鼠骨髓中性粒细胞，检测ROS产生和PMA诱导的NET形成（MPO-DNA复合物和dsDNA）。
Cd177中性粒细胞特异性敲除小鼠肺IRI模型验证
验证CD177+中性粒细胞对肺IRI损伤的致病作用
在Cd177flox/flox; Ly6gCre和Cd177flox/flox对照小鼠中建立左肺门夹闭IRI模型，评估肺损伤评分、NET浸润和肺功能指标。
外周血Cd177+中性粒细胞来源与动力学分析
追踪肺内Cd177+中性粒细胞的来源及分化状态
对小鼠外周血中性粒细胞进行scRNA-seq，鉴定PBN1–4亚群，比较PBN3与LAN3的基因表达、骨髓邻近评分及拟时序分化轨迹。
人肺移植受者队列中CD177+中性粒细胞的预测价值评估
评估外周血CD177+中性粒细胞比例变化对grade 3 PGD的早期预测能力
收集104例肺移植受者移植前和移植后4 h外周血，流式检测CD177+中性粒细胞比例，计算ΔCD177+中性粒细胞，并与NLR比较，进行ROC和logistic回归分析。
CD177+中性粒细胞代谢特征分析
探究CD177+中性粒细胞的代谢通路特征
对scRNA-seq数据用scMetabolism评估代谢通路活性，计算OXPHOS和电子传递链基因评分，并进行人CD177+与CD177−中性粒细胞及小鼠Cd177敲除中性粒细胞的蛋白组学分析。
线粒体复合物I活性及CD177/MAC-1/ILK/AKT/mTOR机制验证
验证CD177通过MAC-1/ILK/AKT/mTOR轴上调线粒体复合物I并增强OXPHOS的机制
检测人CD177+与CD177−中性粒细胞的OCR、线粒体超微结构、MitoSOX、蓝白非变性电泳复合物I–V、CD11b与ILK共免疫沉淀、ILK与AKT相互作用，并使用ILK抑制剂QLT0267、AKT抑制剂ipatasertib/激动剂SC-79、mTOR抑制剂AZD8055/激动剂MHY1485进行干预。
IACS-010759在小鼠IRI和大鼠肺移植模型中的治疗效果评估
验证线粒体复合物I抑制剂IACS-010759对肺IRI的治疗作用
在小鼠左肺门夹闭IRI模型和大鼠原位左肺移植模型（冷缺血18 h，再灌注2 h）中，术前3 h尾静脉注射IACS-010759（1 mg/kg），评估肺损伤评分、NET浸润、肺功能和Cd177+中性粒细胞比例及OXPHOS评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | PE抗人CD177抗体 | Biolegend | 315806 |
| PE/Cyanine7抗人CD45抗体 | Biolegend | 368532 | |
| FITC抗人CD66b抗体 | Biolegend | 305104 | |
| FITC抗小鼠Ly-6G抗体 | Biolegend | 127606 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠/人CD11b抗体 | Biolegend | 101216 | |
| PerCP-Cyanine5.5抗小鼠/人CD45抗体 | ThermoFisher | 45-0451-82 | |
| 免疫荧光 | 兔多克隆抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体 | Abcam | ab281584 |
| 大鼠单克隆抗Ly-6G抗体 | BD biosciences | 551459 | |
| 小鼠单克隆抗组蛋白H1抗体 | Abcam | ab218417 | |
| 兔单克隆抗CD177抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376329 | |
| Western blot | 兔多克隆抗CD177抗体 | Abclonal | A6550 |
| 兔多克隆抗NDUFS1抗体 | Protientech | 12444-1-AP | |
| 兔单克隆抗ILK抗体 | Abcam | ab52480 | |
| 兔单克隆抗AKT抗体 | Abcam | ab179463 | |
| 兔单克隆抗磷酸化AKT抗体 | Abcam | ab192623 | |
| 兔单克隆抗mTOR抗体 | Abcam | ab134903 | |
| 兔单克隆抗磷酸化mTOR抗体 | Abcam | ab109268 | |
| 药物处理 | IACS-010759 | MCE | HY-112037 |
| MHY1485 | MCE | HY-B0795 | |
| AZD8055 | MCE | HY-10422 | |
| SC-79 | MCE | HY-18749 | |
| Ipatasertib | MCE | HY-15186 | |
| QLT0267 | Cayman Chemical | 866409-68-9 | |
| 器官保存 | Celsior保存液 | Genzyme Corp | -- |
| 中性粒细胞分离 | PolymorphPrep密度梯度分离液 | Axis Shield | 1114683 |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Biosharp | BL503B |
| 流式细胞术 | 人BD Fc阻断剂 | BD biosciences | 564220 |
| 小鼠BD Fc阻断剂 | BD biosciences | 553141 | |
| FACS缓冲液 | BD biosciences | 554656 | |
| LIVE/DEAD可固定远红死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher | L34973 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| NET检测 | Sytox green核酸染料 | Alphabio | AP6352 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| PMSF和磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1045 | |
| 蓝白非变性电泳 | 洋地黄皂苷 | Invitrogen | BN2008 |
| 考马斯亮蓝G250 | Invitrogen | BN2008 | |
| 深蓝阴极运行缓冲液 | Invitrogen | BN2002 | |
| 亮蓝阴极运行缓冲液 | Invitrogen | BN2007 | |
| 透射电子显微镜 | 电镜固定液 | Servicebio | G1102 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX深红线粒体超氧化物指示剂 | Dojindo | MT14 |
| 线粒体染色 | MitoTracker红CMXRos线粒体染料 | Beyotime | C1049B |
| 组织保存 | MACS组织保存液 | Miltenyi | 130-100-008 |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Thermo Fisher | 17100017 |
| 中性蛋白酶 | Roche | 04942086001 | |
| DNA酶 | Roche | 10104159001 | |
| 中性粒细胞分离 | 小鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒 | Solarbio | P8550 |
| MPO-DNA ELISA | 人髓过氧化物酶ELISA试剂盒 | Abcam | ab119605 |
| 小鼠髓过氧化物酶ELISA试剂盒 | Abcam | ab275109 | |
| 基因分型 | 小鼠直接PCR试剂盒 | Selleck | B40013 |
| dsDNA定量 | Qubit双链DNA定量试剂盒 | Thermo Fisher | Q32851 |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Servicebio | G1706-100T |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR037A |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus） | TaKaRa | RR820A |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
| 免疫共沉淀 | Thermo Scientific Pierce共免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher | 26149 |
| 线粒体提取 | 线粒体提取试剂盒 | Beyotime | C3601 |
| scRNA-seq文库构建 | DNBelab C系列HT单细胞RNA文库构建试剂盒 | MGI | 940-000047-00 |
| scRNA-seq质控 | Qubit单链DNA定量试剂盒 | ThermoFisher | Q10212 |
| Stereo-seq文库构建 | STOmics基因表达试剂盒S1 | BGI | 1000028493 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肺IRI模型 | 小鼠品系C57BL/6J（雄性，8–10周龄，20–22 g）、左肺门夹闭缺血1 h再灌注3 h、sham对照、IRI组n=6/sham组n=4、CD45+细胞分选 阅读提示：STAR Methods“Mouse left hilar-clamp model”及Figure 1 legend |
| 大鼠原位左肺移植模型 | SD大鼠（雄性，8–10周龄，250–300 g）、供肺4°C Celsior保存18 h、再灌注2 h、cuff技术吻合、sham对照、n=5–6/组 阅读提示：STAR Methods“Rat orthotopic left lung transplantation model”及Figure 5 legend |
| 人肺移植受者队列 | 104例LTRs，其中25例grade 3 PGD；移植前和移植后4 h采血；EDTA抗凝；PGD分级依据2016 ISHLT标准；流式检测CD177+中性粒细胞比例；ΔCD177+计算方式 阅读提示：STAR Methods“Study participants”及Figure 3 legend、Table S9–S11 |
| CD177+与CD177−中性粒细胞分选 | 人外周血中性粒细胞密度梯度分离（PolymorphPrep）；CD177-PE、CD45-PE/Cy7、CD66b-FITC标记；流式分选纯度>95%；小鼠骨髓中性粒细胞用试剂盒分离 阅读提示：STAR Methods“Neutrophil isolation”和“Cell culture” |
| ROS和NET功能实验 | 细胞数（ROS 1×105/孔，NET 5×106/孔）、PMA 100 nM、培养12 h、DCFH-DA 10 μM 37°C 30 min、MPO-DNA ELISA、Sytox green染色、n=5/组 阅读提示：STAR Methods“Detection of NETs”“Measurement of intracellular ROS”及Figure 2 legend |
| IACS-010759体内处理 | IACS-010759 1 mg/kg，DMSO+生理盐水溶解，术前3 h尾静脉注射，vehicle等体积对照，小鼠n=5/组，大鼠n=5–6/组 阅读提示：STAR Methods“Mouse left hilar-clamp model”和“Rat orthotopic left lung transplantation model”、Figure 5 legend |
| ILK/AKT/mTOR通路干预 | QLT0267 3 μM、Ipatasertib 1 μM、SC-79 4 μg/mL、AZD8055 1 μM、MHY1485 10 μM，均预处理1 h，DMSO对照 阅读提示：STAR Methods“Pharmacological modulation of ILK, AKT and mTOR”及Figure 4、Figure S6 legend |
| 线粒体呼吸OCR检测 | Seahorse XFe96，每孔20,000细胞，XF medium含1 mM sodium pyruvate、2 mM glutamate、11 mM glucose；依次注射oligomycin 1 μM、FCCP 0.5 μM、rotenone/antimycin A 0.5 μM；三个循环读数 阅读提示：STAR Methods“Mitochondrial respiration”及Figure 4G、Figure 5A legend |
| Stereo-seq空间转录组 | 肺组织OCT包埋10 μm切片、STOmics Gene Expression kit S1、25×25 μm bin、watershed分割、2张IRI肺切片、1,374个中性粒细胞 阅读提示：STAR Methods“Stereo-seq library preparation and sequencing”及Figure 2 legend |
| scRNA-seq数据分析 | 细胞过滤标准（>500基因、>1,000 UMI、>10,000 reads、<10%线粒体基因）、DoubletFinder去双细胞、Harmony去批次（dims 1:20）、DEG阈值（logFC=0.25，adj p<0.05，Bonferroni校正） 阅读提示：STAR Methods“scRNA-seq data processing” |