衰老相关颗粒细胞模型建立与MOTS-c处理
建立衰老相关颗粒细胞模型并确定MOTS-c处理条件
将早期传代HGL5细胞每2天传代约3个月获得晚期传代（>P50）细胞，用50 μM MOTS-c处理24小时，对照接受等体积溶剂。
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线粒体衍生肽MOTS-c改善衰老相关颗粒细胞和卵母细胞的生物能量学
The Mitochondrial-Derived Peptide MOTS-c Improves Bioenergetics in Aging-Associated Granulosa Cells and Oocytes
实验完整度
高包含HGL5细胞模型、小鼠离体卵母细胞实验及公共转录组数据分析，并有线粒体功能、代谢酶和粘附蛋白等功能验证。
主要模型
晚期传代HGL5人颗粒细胞系 年轻（<12周）和年老（>34周）C57BL/6J小鼠离体卵母细胞 公共颗粒细胞转录组数据集（GSE130664、GSE107746）
重点核对
晚期传代HGL5细胞定义为>50代，经SA-β-gal活性和p16/p27表达验证衰老 MOTS-c浓度50 μM，处理24小时 Seahorse分析中依次注射oligomycin（1 μM）、FCCP（1 μM）和antimycin A/rotenone（0.5 μM） 小鼠年龄分组：年轻<12周，年老>34周 离体卵母细胞培养24小时，第一极体排出率由盲法研究人员评分
摘要
卵巢衰老损害颗粒细胞功能、线粒体稳态、代谢和卵母细胞质量。我们使用衰老相关HGL5颗粒细胞模型、年轻和年老小鼠的离体卵母细胞以及公共颗粒细胞转录组数据集，研究线粒体衍生肽MOTS-c是否减轻这些缺陷。在HGL5细胞中，MOTS-c增加线粒体质量和ATP相关荧光，而不增加细胞或线粒体活性氧，同时质量归一化的膜电位保持不变。Seahorse分析显示ATP关联呼吸和最大呼吸增加、备用呼吸能力增加、质子漏减少，而基础呼吸不变。MOTS-c还重塑了参与糖酵解、乳酸-丙酮酸处理和丙酮酸-TCA代谢的酶的表达。尽管裂变标志物基本不变，但MOTS-c增加了与抗氧化防御、线粒体运输、细胞连接、粘附信号和颗粒细胞功能相关的蛋白质水平，包括NRF2、磷酸化AIFM1、RHOT1、KIF5B、ZO-1、E-钙粘蛋白、磷酸化FAK和AMH。年老卵母细胞表现出第一极体排出减少、DCFDA荧光增加和CMXRos强度降低。离体MOTS-c处理增加了培养后第一极体阳性率和线粒体相关荧光，同时降低了氧化应激相关荧光，尽管结果仍低于年轻参照水平。对人类卵泡发生和非人灵长类卵巢衰老数据集的再分析进一步揭示了MOTS-c相关代谢程序的年轻富集趋势。这些发现提示MOTS-c改善衰老相关颗粒细胞的代谢、线粒体和结构特征，并增强年老卵母细胞的成熟相关结果，支持进一步研究基于MOTS-c的生殖衰老策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MOTS-c是否可改善衰老相关颗粒细胞功能障碍和年老卵母细胞的成熟相关结局？
- 核心机制
- MOTS-c促进颗粒细胞代谢重塑（增强糖酵解、改变乳酸-丙酮酸处理、增加丙酮酸-TCA酶）、线粒体保护/运输相关蛋白和连接/粘附标志物表达，而不诱导氧化应激；这些效应与卵母细胞保护作用被视为独立平行获益。
- 主要证据
- 在晚期传代HGL5细胞中，MOTS-c增加线粒体质量、ATP相关荧光、ATP关联呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力，降低质子漏，并上调HK2、ENO1、PKM1、LDHB、PDHA、CS、ACO1、IDH1、NRF2、p-AIFM1、RHOT1、KIF5B、ZO-1、E-cadherin、p-FAK和AMH；在年老小鼠离体卵母细胞中，MOTS-c提高第一极体阳性率、降低DCFDA荧光并增加CMXRos荧光。
- 研究意义
- 提示MOTS-c可促进衰老颗粒细胞的代谢、线粒体和结构支持程序，并对年老卵母细胞有直接保护作用，为线粒体衍生肽策略改善生殖衰老中的卵母细胞质量提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
线粒体质量和氧化还原状态检测
评估MOTS-c对颗粒细胞线粒体质量和活性氧的影响
流式细胞术检测MitoTracker Green、TMRE、ATP-Red、DCFDA和MitoSOX荧光，TMRE以MitoTracker Green归一化。
线粒体呼吸功能分析
评估MOTS-c对颗粒细胞线粒体呼吸和备用呼吸能力的影响
Seahorse XF HS Mini分析耗氧率，依次注射oligomycin、FCCP和antimycin A/rotenone，测定基础呼吸、ATP关联呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、质子漏和非线粒体呼吸。
代谢酶和线粒体/结构相关蛋白表达检测
验证MOTS-c对糖酵解、乳酸-丙酮酸代谢、TCA循环及线粒体保护和粘附连接蛋白的影响
Western blot检测HK2、ENO1、PKM、LDHA、LDHB、PDHA1、CS、IDH1、ACO1、FH、p-DRP1、DRP1、MID49、MID51、NRF2、AIFM1、p-AIFM1、RHOT1、KIF5B、ZO-1、E-cadherin、FAK、p-FAK、Paxillin和AMH等蛋白。
年老卵母细胞离体成熟和氧化还原状态评估
评估MOTS-c对年老小鼠卵母细胞成熟和线粒体/氧化还原指标的影响
从年轻（<12周）和年老（>34周）C57BL/6J小鼠收集卵丘-卵母细胞复合体，脱去卵丘细胞后，年老卵母细胞随机接受溶剂或50 μM MOTS-c处理24小时，年轻卵母细胞作为参照；评估第一极体排出率、DCFDA和CMXRos荧光。
公共转录组数据验证
在独立转录组数据中验证MOTS-c相关代谢程序与衰老和卵泡发生的关系
分析GSE130664（年轻和年老食蟹猴卵巢单细胞RNA-seq）和GSE107746（人类颗粒细胞五个卵泡发生阶段RNA-seq），计算MOTS-c相关代谢、线粒体保护/运输、连接/支持和OXPHOS模块评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Ultroser G | -- | -- | |
| ITS Plus | -- | -- | |
| 药物处理 | MOTS-c | Targetmol | TP2312 |
| 流式分析 | MitoTracker Green | -- | -- |
| TMRE | -- | -- | |
| BioTracker ATP-Red活细胞染料 | -- | -- | |
| DCFDA | -- | -- | |
| MitoSOX Red | -- | -- | |
| Seahorse分析 | 寡霉素 | -- | -- |
| FCCP | -- | -- | |
| Western blot | ZO-1抗体 | Cell Signaling Technology | 5406 |
| RHOT1抗体 | GeneTex | GTX3283 | |
| Paxillin抗体 | GeneTex | GTX633769 | |
| 磷酸化FAK Tyr397抗体 | GeneTex | GTX129840 | |
| FAK抗体 | GeneTex | GTX82780 | |
| α-tubulin抗体 | GeneTex | GTX628802 | |
| β-actin抗体 | GeneTex | GTX629630 | |
| AMH抗体 | GeneTex | GTX129593 | |
| 磷酸化Drp1 Ser637抗体 | Abcam | ab193216 | |
| Drp1抗体 | Abcam | ab56788 | |
| E-钙粘蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| MID49抗体 | Proteintech | 28718-1-AP | |
| MID51抗体 | Proteintech | 20164-1-AP | |
| NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 磷酸化Drp1 Ser616抗体 | ABClonal | AP0849 | |
| KIF5B抗体 | ABClonal | A15284 | |
| HK2抗体 | ABClonal | A0994 | |
| ENO1抗体 | ABClonal | A1033 | |
| PKM抗体 | ABClonal | A0268 | |
| LDHA抗体 | ABClonal | A1146 | |
| LDHB抗体 | ABClonal | A7625 | |
| PDHA1抗体 | ABClonal | A1895 | |
| CS抗体 | ABClonal | A5713 | |
| IDH1抗体 | ABClonal | A2169 | |
| ACO1抗体 | ABClonal | A7867 | |
| FH抗体 | ABClonal | A5688 | |
| AIFM1抗体 | Elabscience | E-AB-10123 | |
| 磷酸化AIFM1 Ser116抗体 | ECM BD Biosciences | AP5501 | |
| 动物实验 | 马绒毛膜促性腺激素 | -- | -- |
| 人绒毛膜促性腺激素 | -- | -- | |
| 卵母细胞脱颗粒细胞 | 透明质酸酶 | -- | -- |
| ICSI Cumulase | -- | -- | |
| 卵母细胞荧光染色 | CM-H2DCFDA | -- | -- |
| CMXRos | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 衰老相关HGL5细胞模型建立 | 晚期传代HGL5细胞定义为>50代，经SA-β-gal活性和p16/p27表达验证衰老；具体传代时间和培养条件需核对 阅读提示：Materials and methods – Cell culture and MOTS-c treatment及Supplementary Fig. S1A和B |
| MOTS-c处理 | MOTS-c浓度50 μM，处理24小时；溶剂为双蒸水，使用前稀释于完全培养基 阅读提示：Materials and methods – Cell culture and MOTS-c treatment及Supplementary Fig. S1C |
| Seahorse线粒体呼吸分析 | 每孔2,000个细胞；oligomycin 1 μM、FCCP 1 μM、antimycin A/rotenone 0.5 μM；实验独立重复3-5次，每次3个技术复孔；OCR以总蛋白归一化 阅读提示：Materials and methods – Seahorse extracellular flux analysis |
| 小鼠离体卵母细胞实验 | 年轻<12周，年老>34周；超排卵用5 IU eCG，48小时后5 IU hCG；hCG后14-16小时收集COCs；MOTS-c 50 μM处理24小时；第一极体排出率由盲法研究人员评分 阅读提示：Materials and methods – Animal experiments and ex vivo oocyte culture及Figure 5 legend |
| 公共转录组数据分析 | GSE130664质控阈值：nFeature_RNA≥200且≤6,000，percent.mt≤15；聚类分辨率0.4；供体水平中位数评分；Wilcoxon秩和检验；GSE107746用Kruskal-Wallis检验和Spearman趋势分析 阅读提示：Materials and methods – Public transcriptomic validation |